李建涛 刘宪华 何耀东 汪光义

（1. 天津大学环境科学与工程学院，天津 300072；2. 天津大学海洋生态环境研究中心，天津 300072）

二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）是一种ω-3 系列多不饱和脂肪酸，对维持人体的正常生理功能至关重要［1］。DHA 是细胞膜磷脂的组成成分，参与脑细胞和视网膜的正常发育，具有预防心血管疾病、高血脂等疾病的功效［2］。随着人们生活水平的不断提高与对DHA 生物医药价值的认识的不断深化，DHA 的需求量也不断上升。2017 年以DHA 为主要产品的ω-3 不饱和脂肪酸的全球销售额预计可达43 亿美元，并在最近5 年内有望保持6.6%的年增长率，市场需求量巨大［3］。鱼油是DHA 生产的传统来源，但其产量受到季节影响，且渔业捕捞量有限，难以满足不断增长的需求［4］。产DHA 微生物，如破囊壶菌（Thraustochytrium）、裂殖壶菌（Schizochytrium）和隐甲藻（Crypthecodinium）等，具有生长速度快、细胞内DHA 和脂肪酸含量高等优势，可作为DHA 生产的替代来源。据报道，在最适培养条件下，破囊壶菌生物量可高达55.64 g/L，DHA 含量为12.61 g/L［5］；裂殖壶菌的生物量和DHA 可以达到44.09 g/L 和5.25 g/L［6］；寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）经优化补料发酵培养后，生物量达到60.09 g/L，油脂和DHA 产量分别达28.8 g/L 和11.34 g/L［7］，极具工业化生产DHA 的潜力。

在发酵生产DHA 过程中，野生菌种存在着生长退化、适应性差等问题［8］。另外，在这些产油微生物中，DHA 在总油脂中的比例较低。这些因素阻碍了DHA 产业化生产。传统的发酵优化策略已难再提高DHA 的产量，虽然获取的生物量已相当可观，但如果能进一步提高DHA 在总油脂中的比例，培育出DHA 高产微生物新菌株，才能从根本上解决产油微生物中DHA 产量低下的问题。其中诱变育种通过物理、化学和生物手段，引起细胞核碱基缺失、染色体断裂、基因重组等生物学效应，从而使后代性状发生改变，人为引入大量的突变［9-10］。通过筛选，可获得具有稳定产量、适应多样化发酵条件的新菌种，提高DHA 产量［11］。因此，本文综述了诱变育种技术在产油微生物中的应用，提出了筛选获取新菌株以提高DHA 产量的解决方法，分析了不同诱变育种方式在产油微生物生产DHA 方面的研究现状，总结出不同诱变育种方式相结合的复合育种思路，希望对今后微生物产DHA 研究有所启发。

1 物理诱变

1.1 传统物理诱变

在物理诱变中使用的高能辐射通常包括电磁辐射（如γ 射线、X 射线和紫外线）和粒子辐射（如快中子和热中子、离子束、α 和β 粒子）［12］。物理诱变具有操作方便安全、应用范围广、突变率高和相对实验结果比较理想等优点，在工业微生物育种方面得到了广泛的应用［13］。

国内物理诱变在微藻中较早的研究是利用半导体激光对紫球藻进行照射，发现合理的诱变时间可以加快紫球藻的生长和提高胞外多糖［14］。之后，越来越多的研究者逐渐把物理诱变技术应用到微生物产DHA 上。一般在使用诱变手段处理时，需要优先确定最佳实验条件、实验剂量，再定性定量分析突变株的具体成分，复筛得到目的菌株。如佘隽等［15］对寇氏隐甲藻采用60Co-γ 射线辐照诱变时，初筛得到27 株生长速度快、藻体细胞体积大和油脂有明显增加的突变体。经过摇瓶发酵培养试验复筛后，最终获得一株较出发藻有明显优势的突变株。该突变株油脂产量和DHA 产量比出发株分别提高51.66%和56.92%，DHA 产量为7.14 g/L，含量达到39.04%。吕小义等［16］使用同样的手段处理裂殖壶菌后，其摇瓶发酵生物量为47.37 g/L，油脂含量为31.41%，DHA 产量为5.65 g/L，比出发藻株提高约40%。这些研究结果表明产油微生物经γ 射线诱变照射后，筛选获得的突变菌株生长速度和细胞形态大小均优于原始菌株，且油脂和DHA 产量也有明显提高。

与激光和γ 射线等诱变手段相比，离子束诱变具有生理损伤轻、突变几率高、突变范围广等优点［17］。Fu 等［18］对裂殖壶菌注入低能离子束，通过苏丹黑B 染色液（Sudan black B stain）筛选这些突变体，诱变获得DHA 突变体，其DHA 产量比野生菌株提高了61%。在最佳发酵条件下，突变株的DHA 产量为6.52 g/L，占总脂肪的46.2%。王芝瑶等［19］对微拟球藻Nannochloropsis oceanicaOZ-1 进行以碳重离子束育种时，也获得了两株在生长速度及油脂产率显著优于野生菌株的新突变株。这也是离子束辐射在提高DHA 产量方面取得的有效成果，为揭示离子束诱变机制奠定了研究基础。

由于突变本身具有不定向性，诱变后会初筛出大量的突变株，如果采用摇瓶发酵复筛的手段，逐一定量复筛分析目标产物，这会导致工作量繁重且效率低下等问题。因此，有些研究者开始考虑加入特定的定向筛选剂，从而加快目的突变菌株的选育。例如，蔡恺敏［20］报道，在紫外诱变后采用丙二酸（MA）平板、高糖平板培养、低温培养和红四氮唑（TTC）活性比较等方法，对突变菌株进行了多轮初筛和复筛，得到了一株遗传稳定性较好且DHA 产量达到10.98 g/L 的裂殖壶菌突变株，比初始菌株提高了23%。许永等［21］通过添加脂肪酸合成的抑制剂喹禾灵，也达到了有效筛选裂殖壶菌突变株的目的。他们从紫外照射后的裂殖壶菌突变菌株中选育出2株DHA 含量高的突变菌株，与对照组相比，DHA分别提高了13.74%和28.75%，突变株的DHA 含量达到脂肪酸的37.28%。相比于直接随机筛选诱变后的菌种，筛选剂的加入，大大提高了诱变育种的效率和进程［22］。梁园梅等［23］对破囊壶菌紫外诱变后，通过化学药物喹禾灵和丙二酸胁迫筛选方式，获得高产突变株，DHA 产量比出发菌株提高了11.26%，油脂产量提高了41.01%，油脂突变效果显著。以上研究结果表明在产油微生物中紫外诱变是一种应用最广泛的方法，因其设备简单、操作方便及成本低廉，在诱变过程中采取合适的诱变技术寻找能有效筛选突变株的化学药物，对于获得高产DHA 的产油微生物至关重要。

1.2 新型ARTP诱变

针对传统辐射源的突变频率较低和突变随机性较大等问题，人们又发掘和利用了新的诱变技术。其中，常压室温等离子体（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）新型诱变仪以射频大气压辉光放电（Radio-frequency atmospheric-pressure glow discharge，RF APGD）等离子体射流为核心部件，不仅在设计上有很大的改进，而且具有突变快、突变多样性高、简单易行等诸多优势［24］。由于等离子体（Plasma）射流中含有种类丰富的化学活性粒子（如处于激发态的He、O、N2、OH 等），可直接或间接作用于细胞内的遗传物质，造成DNA 分子的断裂，引起细胞多样性突变［25］。目前，ARTP 技术已经成功应用在细菌、真菌、微藻等微生物，已成为快速突变微生物基因组的有效方法之一［26］。

ARTP 对DNA 损伤机制具有多样性，且ARTP的基因损伤效应比紫外和化学突变要更强，会有更多的基因突变位点，获得突变体的可能性也会越来越高，这就是ARTP 在基因组庞大、代谢网络复杂的微生物诱变中具有优势的原因［27］。大多数情况下，经ARTP 处理后的突变体筛选也会加入特定的筛选剂。龚定芳等［28］报道在含有碘乙酸、丙二酸及丙二酸-碘乙酸等复合平板上涂布经ARTP 辐射过的裂殖壶菌，筛选出的菌株GC 定量分析得出高产突变体，生物量、油脂总量、DHA 产量与原始菌株相比分别提高了18.11%、14.87%和46.12%，DHA 产量为6.59 g/L。丙二酸可以提供脂肪酸合成的前体物质，玉米醇溶蛋白阻止细胞分裂和繁殖。Zhao 等［29］利用常压室温等离子体照射裂殖壶菌后，经丙二酸和玉米醇溶蛋白抗性筛选，得到的突变株DHA 产量增加了1.8 倍，添加微量元素Fe2+后摇瓶培养，可产生14.0 g/L 的DHA。利用ROS 诱导剂2.2′-联吡啶可以淘汰掉抗氧化能力较弱的菌株以得到抗氧化能力较强的菌株，这样筛选出的突变体可能具有较高的DHA 生产能力。袁军等［30］报道了利用ROS 诱导剂2.2′-联吡啶并结合磷酸香草醛快速定性检测油脂法，最后得到一株DHA 产量比初始菌株提升了29.8%的突变菌株。这些研究结果说明了ARTP 技术对选育高产DHA 微生物具有良好的应用潜力，并且也需要添加有效的筛选剂以增加筛选效率，进一步验证了筛选剂所具有的重要意义。

目前采用ARTP 对藻类的诱变报道仍然较少，主要集中在对胞内多糖和脂质的研究，但这为后续藻类诱变产生DHA 提供了可靠的实验依据。螺旋藻（Spirulina platensis）是一种潜在的通过固定二氧化碳产生多糖的微藻，以往通过物理化学方法均没有得到碳水化合物含量提高的突变菌株。Fang 等［31］报道经ARTP 处理的螺旋藻有两株突变株细胞内的碳水化合物分别增加了40.3%和78.0%，突变率和正向突变率分别为45%和25%。ARTP 在寇氏隐甲藻高产脂质方面也已有研究。Liu 等［32］用ARTP 产生突变体后，在含有稀禾定（Sethoxydim）的培养基筛选得到的突变体，生长速度比野生型高24.32%，脂质含量比野生型高7.05%。与野生型菌株相比，突变株中Accase 的酶活性增加了16.15%，转录组学分析表明其编码基因上调了1.53 倍，表明ARTP诱变确实改变了脂肪酸基因的表达。这些研究揭示了诱变可以改变野生型藻种的生化特征，也证明了ARTP 技术对于微藻是一种有效的诱变技术。因此，加强ARTP 在微藻方面的深入研究是未来一段时间内的重点方向，工业前景潜力巨大。

其他新型物理诱变方式主要包括超高压、高能电子流、电磁场、热（温度）等一系列诱变技术，在微生物诱变育种方面也发挥着积极的作用，促进生物进化研究和工业菌种改造，但是在生产DHA 方面还未见报道，所以这些新技术也给未来产油微生物诱变育种开辟了一个新方向。

2 化学诱变

化学诱变剂主要造成DNA 烷基化损伤或者形成碱基化合物，碱性诱变条件下，在内切酶作用、碱基和部分核苷酸切除修复作用以及不稳定的DHA 加合物等一系列因素下引起DHA 链的断裂［33］。化学诱变剂种类很多，在诱变育种方面应用较广泛的有甲基磺酸乙酯（Ethyl methyl sulfonate，EMS）、甲基硝基亚硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）、硫酸二乙酯（Diethyl sulfate，DES）等。

与物理诱变处理方法类似，不同化学诱变剂量的使用也会产生不同的影响。赵爱娟［34］采用浓度为0.1 mol/L 的EMS 对小球藻处理40 min 后，其DHA 含量比对照组提高了72.61%。以相同的方法使用0.1 mol/L 浓度EMS 作用于等鞭金藻，其EPA 和DHA 的含量比对照组提高了1.8 倍和1.4 倍。而当EMS 的浓度为0.2 mol/L 时，不饱和脂肪酸的合成受到抑制，EPA 的含量仅提高31.5%。可见选择合适的诱变剂浓度对于获取高产EPA 和DHA 的微藻突变藻种具有重要的影响。陈浩［35］使用MNNG 诱变裂殖壶菌筛选出的突变株生物量达到7.33 g/（L·d），比出发菌株提高65.09%；DHA 含量达到18.05%，提高49.92%，突变株的经济性状优于出发菌株，表明在诱变育种方面MNNG 是良好的化学诱变剂。陈金卿等［36］对双鞭甲藻进行DES 诱变处理，初筛获得的菌株经摇瓶复筛和遗传稳定性验证，发现与出发菌株相比，诱变株的DHA 生物合成量达到45.3 g/L，提高4.7 倍，诱变效果大幅提升，具备优异的工业化生产前景。此外，化学诱变剂单独诱变生产DHA 的研究不多，需要研究者继续开发和探索化学诱变技术，以求应用到更多的产油微生物领域，并且通常情况下会与各种物理诱变方法互相结合。参考物理诱变技术，今后使用化学诱变获取高产DHA新菌株要考虑筛选剂的重要作用。

3 复合诱变

在之前的产油微生物产DHA 的诱变育种研究中，往往采用单一的诱变方法，这会出现诱变效果差、诱变率低、诱变菌株不稳定等一系列问题。近些年，越来越多的研究者尝试在微生物育种中采用多种诱变技术互相结合的方式，结果表明，复合诱变具有协同效应，2 种或2 种以上诱变剂和诱变方法的合理搭配使用，诱变效果较单一诱变有显著的提升［37］。

Lian 等［38］以MNNG 化学诱变和UV 照射物理诱变相结合，提高裂殖壶菌产DHA 的能力。后续实验表明，突变体细胞提取物中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸酶和ATP-柠檬酸裂解酶的活性均高于亲本菌株，这表明诱变方法能有效地提高裂殖壶菌体内的NADPH 和乙酰辅酶A 的供应。突变株的总脂肪酸中的DHA 比列为56.22%，比亲本菌株提高了38.88%，而脂质含量提高了34.84%。王申强［39］通过ARTP-UV 复合诱变，得到了DHA 产量高达11.81 g/L 的突变株，相对于原始菌株提高了75.74%。同时还发现，突变株的发酵周期比原始菌株短了12 h，使其在工业化生产中更具有优势。这表明复合诱变得到的突变株不仅在代谢通路上增加了脂肪酸合成的前体物质，DHA 产量得到了明显提高，而且也有可能使突变株缩短发酵周期，经济效益显著。

与其他研究者不同的是，赵犇等［40］详细比较了复合诱变和单因素诱变之间的区别。他以Schizochxtriumsp.31 为出发株，进行EMS 和ARTP复合诱变，并将复合诱变方法与2 种单因子诱变方法进行诱变效率、诱变后高产株发酵特性及遗传稳定性比较。ARTP 方法中，正突变株的数量占总突变株的比列达到60%左右，而EMS 作用下的正负突变株比列相当，证明ARTP 诱变较EMS 诱变有显著的效果。在2 种单因子诱变方法中，裂殖壶菌突变率差别不大，均介于40%-45%之间，但是EMSARTP 复合诱变后，突变率达到55.7%，明显高于2种单因子诱变方法。在以DHA 为指标考察时，EMS诱变获得的DHA 产量仅为5.74 g/L，ARTP 诱变产生的DHA 为6.28 g/L，EMS-ARTP 复合诱变的DHA产量最高，达到了7.16 g/L。由此可见，复合诱变中2 种或2 种以上诱变技术结合得到的突变体不论在DHA 产量上，还是在突变几率上都比单因子诱变技术有着明显的优势。

目前，对紫外线与氯化锂复合诱变的研究多见于微生物产油脂上，在提高DHA 产量方面暂无报道。例如，石婷婷［41］采用紫外线-氯化锂复合诱变，筛选获得一株总油脂产量提高了49.06%且遗传稳定的菌株隐球酵母菌（Cryptococcus）。而王婷婷等［42］除利用紫外线-氯化锂诱变外，还加入了硫酸二乙酯化学诱变方式，对高山被孢霉（Mortierella alpina）进行诱变育种，结果突变株多不饱和脂肪酸花生四烯酸（AA）的产量提高了141%。由于紫外线-氯化锂复合诱变研究还未涉及DHA 方面，但已有实验数据显示在其他产油微生物上取得了较好的效果。这种诱变方式能大大提高总油脂或多不饱和脂肪酸的产量，因此将紫外线和氯化锂复合诱变技术应用到提高DHA 产量的领域，也是一个值得探索的方向。

4 结语

物理、化学和复合诱变不仅能诱变筛选出高产DHA 新菌株，且大多数情况下获取的突变体在细胞形态或生长状况方面也均优于野生菌株，证明诱变育种能很好解决DHA 产量低的问题，同时在创造产油微生物新种质及生物科技领域发挥重要作用。但仍然存在着突变体筛选效率普遍不高的问题，限制了目的菌株的快速获取，这就要求建立新的高通量筛选方法，以及不断探索和寻求更有效的筛选剂。

诱变技术研究产DHA 的微生物多见于裂殖壶菌和破囊壶菌等，而对藻类诱变育种工作起步较晚，主要集中在寇氏隐甲藻、微拟球藻、小球藻、等鞭金藻、双鞭甲藻等一系列藻种，随着诱变育种技术的快速发展，利用藻类生产DHA 的研究也会得到进一步推动。相对于物理和化学诱变，虽然复合诱变具有突变几率高、适用性强的优势，能够更有效的选育高产DHA 菌株，但是突变进程仍然是随机、不定向的，未来可能会开发出更加先进的诱变育种技术，使微生物定向诱变成为可能，将会大大加速诱变效率，更易获取目的菌株。