尹 俊 庄 红 黄 璐 蒋 伟 代 天 张苏川

(江汉大学附属医院武汉市第六医院心内科,武汉 430000)

多糖类化合物在自然界动植物中广泛存在，其具有抗氧化、抗病毒、增强机体免疫力等多种功能[1,2]。柴胡(bupleurum)又称山地蔬菜和草，是伞形科(umbelliferae)的多年生草本植物，主要含有柴胡皂苷、甾醇、挥发油、脂肪油和多糖，具有疏散解热、舒缓肝脏等功能[3,4]。多糖结构是柴胡生物活性的基础，其为柴胡的重要活性成分之一。因此柴胡多糖的功能研究对疾病的治疗具有重要意义。本研究建立LPS诱导的心肌细胞H9C2损伤模型，观察柴胡多糖对其细胞活性、氧化应激、炎症因子分泌的影响，揭示其机制与调控MAPK/ERK5信号通路相关，为柴胡多糖的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料 乳鼠心肌细胞H9C2购自上海雅吉生物科技有限公司；柴胡饮片购自成都荷花池中药材市场；DMEM培养基、胎牛血清、MTT、胰蛋白酶均购自美国Sellect公司；LDH、ROS、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6检测试剂盒均购自日本TaKaRa公司；PVDF膜购自德国罗氏诊断有限公司；SDS-PAGE 试剂盒、ECL发光液和RIPA蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海锐赛生物。

1.2方法

1.2.1细胞模型的建立及分组 柴胡多糖的提取参考林浩等[5]的方法进行提取，并配制成5、15、45、90 μg/ml 的含量，待用。参考刘丹等[6]的方法建立LPS诱导的心肌细胞损伤模型；参考武剑[7]对柴胡多糖使用剂量的研究设置柴胡多糖(5、15、45、90 μg/ml)剂量组与模型组心肌细胞共培养处理48 h，分别标记为5 μg/ml柴胡多糖+LPS组、15 μg/ml柴胡多糖+LPS组、45 μg/ml柴胡多糖+LPS组、90 μg/ml 柴胡多糖+LPS组。

1.2.2MTT法检测细胞活力 将细胞制成混悬液，调整密度至104个/ml，然后接种至96孔板，取100 μl细胞，每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，终止培养，弃去培养液上清，然后每孔加150 μl DMSO，振荡使结晶充分溶解，在490 nm波长下检测细胞吸光度(A)。

1.2.3ELISA实验检测上清液中LDH、ROS、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6的表达 按照LDH、ROS、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6各自的检测试剂盒要求检测细胞中LDH、ROS、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6的表达。

1.2.4Annexin V-FITC/PI流式细胞术实验 将各组细胞，用 500 μl的Binding Buffer悬浮细胞，分别加入5 μl的 Annexin V-/FITC避光反应20 min后再加入5 μl的PI避光反应20 min，用300目铜筛过滤，最后在1 h内上流式细胞仪结束检测。细胞凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品重复3次。

1.2.5Western blot检测细胞中MAPK、ERK5的蛋白表达 收集细胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min离心10 min。取上清置于EP管，加入5×SDS上样缓冲液，沸水煮沸10 min。电泳后用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉将膜封闭2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃过夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加发光液，曝光。

2 结果

2.1不同浓度的柴胡多糖对LPS致心肌细胞活力的影响 结果如表1所示，与空白组相比，LPS组细胞活力显著降低，LDH含量显著升高；5 μg/ml柴胡多糖+LPS组、15 μg/ml柴胡多糖+LPS组、45 μg/ml柴胡多糖+LPS组、90 μg/ml柴胡多糖+LPS组比LPS组，细胞活力均显著升高，LDH含量显著降低；与5 μg/ml柴胡多糖+LPS组相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS组、45 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞活力均显著升高，LDH含量显著降低；与15 μg/ml柴胡多糖+LPS组相比，45 μg/ml柴胡多糖+LPS组、90 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞活力均显著升高，LDH含量显著降低(P<0.05)。

2.2柴胡多糖减少LPS致心肌细胞ROS生成 结果如表2所示，与空白组相比，LPS组细胞中ROS含量显著升高；与LPS组相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS组、15 μg/ml柴胡多糖+LPS组、45 μg/ml柴胡多糖+LPS组、90 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞中ROS含量均显著降低；与5 μg/ml柴胡多糖+LPS组相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS组、45 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞中ROS含量均显著降低；与15 μg/ml柴胡多糖+LPS组相比，45 μg/ml柴胡多糖+LPS组、90 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞中ROS含量均显著降低(P<0.05)。

GroupsCellviability(%/NC)LDH(U/L)NC100.00±0.00187.74±18.55LPS47.89±3.121)324.26±35.711)5μg/mlBPS+LPS56.66±3.862)283.43±32.462)15μg/mlBPS+LPS65.72±4.342)3)245.53±27.482)3)45μg/mlBPS+LPS73.86±5.822)3)4)201.86±24.122)3)4)90μg/mlBPS+LPS71.74±6.782)219.57±20.122)3)4)F140.15333.114P0.0000.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

GroupsROS(U/ml)NC47.74±11.45LPS264.26±39.421)5μg/mlBPs+LPS193.43±16.352)15μg/mlBPs+LPS145.53±17.592)3)45μg/mlBPs+LPS87.86±13.822)3)4)90μg/mlBPs+LPS94.57±16.352)3)4)F71.519P0.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;Compared with LPS group,2)P<0.05;Compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；Compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

2.3柴胡多糖对LPS致心肌细胞MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性的影响 结果如表3所示，与空白组相比，LPS组细胞中SOD、GSH-Px显著降低，MDA含量显著升高；与LPS组相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS组、15 μg/ml柴胡多糖+LPS组、45 μg/ml柴胡多糖+LPS组、90 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞中SOD、GSH-Px均显著升高，MDA含量显著降低；与5 μg/ml柴胡多糖+LPS组相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS组、45 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞中SOD、GSH-Px均显著升高，MDA含量显著降低；与15 μg/ml柴胡多糖+LPS组相比，45 μg/ml柴胡多糖+LPS组、90 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞中SOD、GSH-Px均显著升高，MDA含量显著降低(P<0.05)。

GroupsMDA(nmol/mgport)SOD(U/mgport)GSH-Px(U/g)NC9.89±1.1683.13±4.53835.27±105.78LPS37.14±3.581)41.39±2.331)395.12±39.611)5μg/mlBPs+LPS28.17±4.072)54.27±3.722)510.74±47.832)15μg/mlBPs+LPS22.53±3.862)3)65.39±3.422)3)633.45±53.272)3)45μg/mlBPs+LPS15.43±3.402)3)4)71.87±4.832)3)4)772.52±60.592)3)4)90μg/mlBPs+LPS15.29±2.682)3)4)73.46±3.462)3)4)781.24±59.722)3)4)F46.05765.13121.647P0.0000.0000.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

图1 流式细胞术检测心肌细胞凋亡Fig.1 Cell apoptosis was detected by flow cytometry

2.4柴胡多糖减少LPS致心肌细胞凋亡 结果如图1和表4示，与空白组相比，LPS组细胞凋亡率显著升高；与LPS组相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS组、15 μg/ml柴胡多糖+LPS组、45 μg/ml柴胡多糖+LPS组、90 μg/ml柴胡多糖+LPS组凋亡率均显著降低；与5 μg/ml柴胡多糖+LPS组相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS组、45 μg/ml柴胡多糖+LPS组凋亡率均显著降低；与15 μg/ml柴胡多糖+LPS组相比，45 μg/ml 柴胡多糖+LPS组、90 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)。

2.5柴胡多糖减少LPS致心肌细胞TNF-α和IL-6的生成 结果如表5所示，与空白组相比，LPS组细胞中TNF-α、IL-6均显著升高；与LPS组相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS组、15 μg/ml柴胡多糖+LPS组、45 μg/ml柴胡多糖+LPS组、90 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞中TNF-α、IL-6均显著降低；与5 μg/ml柴胡多糖+LPS组相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS组、45 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞中TNF-α、IL-6均显著降低；与15 μg/ml柴胡多糖+LPS组相比，45 μg/ml柴胡多糖+LPS组、90 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞中TNF-α、IL-6均显著降低(P<0.05)。

GroupsCellapoptosisrate(%)NC6.59±0.81LPS21.35±1.931)5μg/mlBPs+LPS18.62±1.682)15μg/mlBPs+LPS15.73±1.542)3)45μg/mlBPs+LPS12.52±1.392)3)4)90μg/mlBPs+LPS12.46±1.432)3)4)F36.140P0.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

GroupsTNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)NC24.89±7.4533.25±5.98LPS231.14±20.561)364.26±32.681)5μg/mlBPs+LPS182.17±18.192)253.43±18.272)15μg/mlBPs+LPS 135.53±14.462)3) 175.53±14.742)3)45μg/mlBPs+LPS 67.86±10.242)3)4) 77.86±8.832)3)4)90μg/mlBPs+LPS 79.38±8.742)3)4) 84.57±7.462)3)4)F89.661159.135P0.0000.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

图2 检测心肌细胞中MAPK和ERK5的表达Fig.2 Detected expressions of MAPK and ERK5 in cardiac myocytes

GroupsMAPKERK5NC0.39±0.040.72±0.04LPS0.85±0.061)0.35±0.061)5μg/mlBPs+LPS0.67±0.072)0.53±0.052)15μg/mlBPs+LPS0.54±0.062)3)0.67±0.042)3)45μg/mlBPs+LPS0.36±0.042)3)4)0.79±0.062)3)4)90μg/mlBPs+LPS0.38±0.042)3)4)0.82±0.062)3)4)F41.13034.502P0.0000.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

2.6柴胡多糖抑制心肌细胞MAPK和ERK5表达 结果如图2、表6所示，与空白组相比，LPS组细胞中MAPK蛋白表达量显著升高，ERK5蛋白表达量显著降低；与LPS组相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS组、15 μg/ml柴胡多糖+LPS组、45 μg/ml柴胡多糖+LPS组、90 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞中MAPK蛋白表达量均显著降低，ERK5蛋白表达量均显著升高；与5 μg/ml柴胡多糖+LPS组相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS组、45 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞中MAPK蛋白表达量均显著降低，ERK5蛋白表达量均显著升高；与15 μg/ml柴胡多糖+LPS组相比，45 μg/ml 柴胡多糖+LPS组、90 μg/ml柴胡多糖+LPS组细胞中MAPK蛋白表达量均显著降低，ERK5蛋白表达量均显著升高(P<0.05)。

3 讨论

柴胡多糖是在中药柴胡中提取的一种混合多糖，主要由以下6种多糖组成：D-木糖、核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖或L鼠李糖、L-阿拉伯糖，具有较强的抗溃疡、抗病毒、增强免疫力的作用[8]。王雪峰等[9]通过CVB3m感染建立小鼠心肌损伤模型，通过柴胡、黄芩提取物治疗后发现，小鼠的死亡率明显降低，并且小鼠的心肌组织有明显好转，说明柴胡、黄芩提取物对小鼠心肌损伤具有明显的治疗作用。刘建和等[10]发现，柴胡三参胶囊对缺血再灌注大鼠具有保护作用，其通过调控血清心肌酶和MDA的水平发挥作用。本研究通过LPS建立大鼠心肌细胞损伤模型，运用MTT法检测柴胡多糖对受损心肌细胞活力的影响，发现柴胡多糖可呈浓度依赖性增强细胞活力，LDH含量显著降低，说明柴胡多糖对心肌损伤具有保护作用，这与前人的研究结果均相一致，但其发生作用的机制尚未十分清楚。

心肌损伤的机制包括氧化应激、炎性反应、细胞凋亡及线粒体损伤等，其中氧化应激和炎性损伤是最重要的病理过程[11,12]。韦迎娜等[13]在心肌炎的研究中报道，槲皮素可上调心肌炎乳鼠血清中SOD表达水平，下调MDA和LDH的表达水平，抑制炎症因子IL-1β、IL-6、iNOS的表达水平，并且失活TGF/NF-κB信号通路，发挥抗氧化应激和抗炎的保护作用，降低乳鼠的死亡率。本研究检测发现柴胡多糖治疗的心肌细胞中氧化应激因子ROS、MDA的含量明显降低，SOD、GSH-Px的含量明显升高，细胞核阳性比率明显降低，说明柴胡多糖具有很好的抗氧化应激功能；进一步研究发现，柴胡多糖治疗的心肌细胞中炎症因子TNF-α和IL-6的含量均显著降低，说明柴胡多糖具有明显的抗炎作用，这些结果揭示了柴胡多糖在心肌损伤中通过抗氧化应激和抗炎作用发挥治疗作用，为柴胡多糖在心血管疾病中的治疗奠定了坚实的基础。

MAPK途径由一系列相关蛋白激酶组成，其中ERK1/2(MAPK3/MAPK1)受到最多关注[14-17]。然而，ERK5(MAPK7)与ERK1/2共享许多特性和一些功能，但在分析MAPK在癌发生中的作用和恶性肿瘤的治疗方法时，容易忽略。另外，最近对ERK5在器官发育和细胞分化中的功能探索日益增多，尤其是ERK5在心血管发育过程中的功能[18]。Vassalli等[19]在缺血再灌注心肌损伤的研究中发现p38 MAPK异常活化，促进心肌炎性损伤。韦灵等[20]在研究中发现，在LPS诱导的心肌细胞损伤中MAPK 的mRNA和蛋白表达均发生上调，ERK5的mRNA和蛋白表达均发生下调，而经过氧化苦参碱治疗能够逆转LPS诱导的心肌细胞中MAPK、ERK5的表达，说明MAPK/ERK5信号通路在心肌损伤中具有重要作用。本研究通过Western blot检测了LPS诱导的心肌细胞中MAPK、ERK5的蛋白表达，发现其中MAPK蛋白表达量明显上调，ERK5蛋白表达量明显下调，这与前人的研究结果均一致，再次验证了MAPK/ERK5信号通路在心肌损伤中的重要性。深入研究发现，柴胡多糖可呈浓度依赖性逆转LPS对心肌细胞损伤中MAPK、ERK5表达的影响，说明柴胡多糖具有下调MAPK、上调ERK5的功能，推测柴胡多糖发挥作用的机制可能与调节MAPK/ERK5信号通路密切相关。综上所述，柴胡多糖对LPS诱导的心肌炎具有抗氧化和抗炎的功能，其机制与调控MAPK/ERK5信号通路相关，为柴胡多糖的临床应用提供参考。