延新宇 郑百芹 周 鑫

1.河北省唐山市食品药品综合检验检测中心，河北唐山063000；2.河北省农产品质量安全检测技术创新中心，河北唐山063000

乳果糖是新鲜的液态奶经过巴氏杀菌或超高温瞬时（ultra-high-temperature,UHT）灭菌后，乳糖被异构化，分子中的葡萄糖转化为果糖而形成的一种双糖。在液态奶加热过程中，乳果糖的含量有明显增加，因此乳果糖是衡量新鲜液态奶热处理工艺评定的重要指标之一[1]。

1 乳果糖的概念

20 世纪50 年代，Adachi 发现在牛奶加热过程中，出现了一种合成双糖，这种双糖被称为乳果糖。随着乳果糖的发现，20 世纪60 年代，Richards 等[2]就在脱脂乳粉中检测到了乳果糖。随后，Andrews[3]发现了LA 运转和Amadori 重排反应是形成乳果糖的主要条件。

乳果糖，又名乳酮糖、半乳糖苷果糖和1-4-β-半乳糖苷果糖，是在碱性条件下，乳糖发生异构化产生的一种双糖[3]。乳果糖含有一半分子的半乳糖和一半分子的果糖，是乳糖的同分异构体。

乳果糖是一种低热值、高安全性的还原性二糖，其具有特殊保健功能。乳果糖在消化过程中不能被小肠吸收，进入大肠中被大肠中的双歧杆菌利用，调整肠道菌的平衡，对双歧杆菌起到平衡作用[4]；乳果糖可以降低肠道的pH 值，从而抑制有害菌的繁殖，使体内毒素明显减低；乳果糖被证明具有促进乙肝后肝硬化患者的肝功能恢复和保护肠道黏膜屏障的功能[5]；除此之外，乳果糖还可以用来预防便秘，具有增强身体的免疫力、促进人体对钙、镁的吸收等作用。

2 液态奶中乳果糖的检测方法

由于乳果糖的特殊性，可以将其作为衡量液态奶所经受热负荷的关键指标之一。国内外对乳果糖的检测有着较高的关注。随着分析技术的发展，乳果糖的检测方法越来越简单、快速和精准。目前乳果糖检测存在的最主要问题：液态奶中的乳果糖含量较低，在测定时，高含量的乳糖会对其处理过程和最终检测结果产生影响，因此不同的检测方法也都提出了各自的解决方法。目前，乳果糖的测量方法较多[6-10]，主要有离子色谱法、MTT 显色法、微分pH 计法[11]、生物传感器法、气相色谱法、安培电流计法、离子交换色谱法、酶解法、高效液相色谱法和傅立叶变换红外光谱法等。我国的相关标准中乳果糖的测定方法是酶解法（标准NY/T939-2016）[12]，同时国际标准化组织规定测定乳果糖的方法是ISO 酶法。

2.1 酶 法

酶法是目前应用比较广泛的一种方法。酶法根据酶的添加量和培养温度可分为ISO 酶法和快速酶法。主要原理是利用β- 半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶将乳糖、乳果糖和葡萄糖水解，可以对测定结果减少干扰。然后再利用相关酶将之前产生的果糖一步步水解成NADPH，再测定NADPH 的吸光值就可以得到乳果糖的含量。快速酶法是黄萌萌等[13]将ISO 酶法中水解乳果糖的培养温度从40 ℃提高到50 ℃，从而达到快速测定牛乳中乳果糖含量的目的，最终命名为快速酶法。巴氏杀菌乳和新鲜牛乳都可以用快速酶法来检测乳果糖含量。

利用酶法来检测液态奶中的乳果糖，其方法检出限为1 mg/L，可以很准确地进行测量，具有一定的稳定性和可靠性。但是也存在一些缺点，不仅成本高、检测的时间较长，而且在操作中还容易受到微生物的污染，对检测结果产生干扰。

2.2 色谱法

1）高效液相色谱法。高效液相色谱法（HPLC）主要是利用沉淀剂将液态奶中的蛋白质和脂肪沉淀，然后再通过高效液相色谱测定乳果糖的含量，应用蒸发光散射检测器[14]、示差检测器[15-16]、脉冲安培检测器等检测乳果糖的浓度，其中脉冲安培检测器的灵敏度较高，可以对微量乳果糖进行检测。刘丽君等[17]利用氨基色谱柱分离、示差检测器检测，由于示差检测器稳定性和灵敏度较低的缘故，无法准确地对乳果糖含量较低的灭菌乳进行测量。液相色谱法一般使用反向柱对乳果糖进行分离测定。由于乳果糖和乳糖是同分异构体，二者保留时间相近，很难加以分离，因此选择合适的色谱柱、合适的流动相，对液相色谱法检测乳果糖十分重要。

利用高效液相色谱法来检测乳果糖，若配置脉冲安培检测器来测量，其检测限为0.4 mg/L。高效液相色谱法还可以检测其他糖类的浓度，在测量乳果糖时也可以很好地避免其他糖类的干扰，得到准确值[18-19]。但是在测量乳果糖过程中，其前处理中蛋白质和脂肪的去除比较繁琐。

2）气相色谱法。气相色谱法主要是将液态奶中的蛋白质和脂肪沉淀，之后进行过滤，使用0.01%苯基-β-D- 葡萄糖溶液作为内标对乳果糖的含量进行测定。气相色谱法是一种灵敏度高、准确性高且可重复地检测乳果糖含量的检测方法，并且也可以对其他糖类进行测量。在检测碳水化合物时，要先将多糖分解成为单糖，之后将单糖合理衍生，得到易于气化的物质，再利用气相色谱仪分析。其灵敏度要比高相液相色谱法高。当用利用气相色谱检测乳果糖和分离其他糖类时，一般采用毛细管柱。Montilla 等[20]利用甲烷硅基化糖类的气体毛细管色谱法对乳果糖进行测定，其结果的精密度较高。之后又利用此方法对多种牛奶样品进行测定。其结果表示，此方法具有较高的准确性、重复性，并且可以很好地分离乳糖和乳果糖。

利用气相色谱法来检测乳果糖，其定量限为50～100 mg/L。但是有报道称利用毛细管柱，采用特定的温度梯度，对乳果糖进行测量，其检测限低至0.50 mg/L。气相色谱法具有操作简便、测定周期短的优点，但是液态乳中其他糖类需要合理地进行衍生，从而更好地提高检测的灵敏度。

3）离子色谱法。离子交换色谱法也是常见的乳果糖检测方法之一。Tommaso 等[21]采用氢氧化钠溶液和乙酸钡作为淋洗液，用阴离子交换分离和脉冲安培检测方法检测。该方法存在缺点，易生成碳酸钡沉淀，柱子的使用寿命和淋洗液的稳定性都受到了影响。2008 年曾文芳等[22]采用了氢氧化钠和乙酸钠作为淋洗液，阴阳离子交换分离，该方法可以使淋洗液预处理简单化，从而得到无毒、价廉的淋洗液。

4）薄层色谱法。薄层色谱法是以薄层吸附剂为固定相，溶剂为流动相，能够快速分离和定性分析少量物料。朱桂兰等[23]在2004 年通过薄层色谱仪检测低聚糖乳果糖，建立了低聚乳果糖的薄层色谱分析法。薄层色谱法具有微量、快速、分离效率高和灵敏度高等优点，但该方法只能作为定性不能作为定量分析。

2.3 其他方法

微分pH 计法也可以对乳果糖的含量进行测定。其主要原理是由于分解葡萄糖和果糖时产生H+，从而利用微分pH 计来测定pH 值，根据pH 值变化来分析出被分解的乳果糖的含量。在实际样品中，最低pH 值变化可以缩小到0.01 mpH。此外MTT 显色法也是通过相应的酶水解乳果糖，溶液最后产生带有颜色的MTT，再利用分光光度计来定量检测。这些方法虽然测定周期短且灵敏度高，但是由于操作比较繁琐且处在实验室研究阶段，所以并没有得到广泛的推广。

3 结语

ISO 酶法是目前比较成熟的一种检测方法，其应用的仪器相对操作简单，能够很准确地对乳果糖进行测定；色谱法具有很高的分辨率和准确性，其中高效液相色谱法和气相色谱法都是发展很高的技术，并且有大量的研究正在对乳果糖进行检测。其中气相色谱法的不足之处为需要将乳果糖合理衍生。而相对应用较少的MTT 显色法和微分pH 计法等方法，这些方法虽然测定周期短且灵敏度高，但是由于操作比较繁琐，目前还没有很好地进行普及。就酶法和色谱法而言，酶法比大多数色谱法定量限低且操作简便，但是其中高效液相色谱法具有很高的分辨率且能准确分离乳果糖和其他糖类。

随着乳果糖近年来逐渐被重视，对其检测技术也在不断探索。目前，国内外对液态奶中乳果糖的检测技术研究十分关注。虽然针对液态奶中乳果糖含量的检测方法已有大量研究，但是还没有一种高效、低成本、操作简便且抗干扰强的技术出现。因此，建立一种高效、快速、灵敏的检测技术具有重要意义。