猪伪狂犬病毒的分离鉴定及TK独立基因的测序分析

2020-02-16

兽医导刊 2020年1期

伪狂犬病是由疱疹病毒科α亚科中的Ⅰ型疱疹病毒所引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的高度致死性疾病。猪是本病毒最重要的贮存宿主和传染源。猪感染伪狂犬病毒后的症状因日龄不同而异，妊娠母猪感染后引起流产，产木乃伊胎和死胎；哺乳仔猪感染后出现神经症状，麻痹、衰竭死亡，死亡率几乎高达100%。成年猪一般为隐性感染，不表现临床症状，但病毒可在猪体内保存很长时间[6]。该病在猪群中具有传播快、死亡率高、流行范围广、传播途径多、病原体顽固等特点。我国自1947年刘永纯[1]首次报道以来，随着养猪业集约化、规模化的发展，已有20多个省、市相继报道过本病。该病属于典型且极难防疫的自然疫源性疾病之一。近几年猪伪狂犬病在我国许多省市种猪场呈爆发流行趋势[2,3]，已成为危害中国养猪业最严重的疫病之一，造成了巨大的经济损失[4,5]。

猪伪狂犬病毒基因组为线状双链DNA，在核内DNA以高分子量的连环体存在，核苷酸链长度约为150kb，基因由独特的长区段（UL）和短区段（US）及位于US两侧的末端重复序列（TR）和内部重复序列（IR）所组成，大约可编码70-100种蛋白质。其中胸腺激酶（TK）基因是伪狂犬病毒的非必需基因同时也是主要的毒力基因之一，它与病毒在机体中的潜伏感染和神经组织中的增殖有关[7,8]。

本实验室从某猪场送检的肺、脾、肾等病料中分离鉴定出1株伪狂犬病毒，对其进行TK基因测序，并与国内外其他分离株进行了序列比较，旨在弄清伪狂犬病毒流行特点、来源及其他毒株的亲缘关系等，为该病的分子流行规律、遗传变异、疾病防控及基因工程疫苗的研制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 Ik88u病料病料采集于2014年6月，病料来源于某临床病例疑似伪狂犬病病猪的肺、脾、肾等组织。

1.1.2 主要试剂 DL2000 DNA Maker、rTaq with GC Buffer购自宝生物工程有限公司。病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒购自博迈德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料组织的处理无菌的取病料剪碎后加入PBS(0.1 mol/L，pH 7.2)，用组织研磨棒研碎，制成1:5的悬液，反复冻融3次，12000r/min 离心15min，取上清，-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物的设计与合成引物参照周斌等[9]建立的PCR体系所涉及的序列，扩增部分gE基因，扩增片段长度为850bp。引物序列为：上游引物：5‘CCCTGGACGCGAACGGCACGATG3’，下游引物：5’GGGTGGCACGCGCTCTCGAAGCA3’。引物根据GenBank已公布的PRV TK基因序列，通过Primer 5.0生物软件设计出一对引物，上游引物：5‘AGGCGTTCG TAGAAGCGGTTGT3’，下游引物：5’GCACGGCAAACTTTATTGGGAT3’。预期扩增片段长度为1400bp。引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.2.3 病毒DNA的提取及PCR鉴定将上述处理的病料组织液，用博迈德的病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒提取病毒DNA作为模板，利用上述引物分别扩增PRV gE、PRV TK 基因片段。PCR总体积为25μL，反应体系如下：2×GC Buffer 12.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，模板 DNA 2μL，上游、下游引物各0.5μL，rTaq DNA聚合酶 0.5μL，去离子水 7μL。PCR 反应程序均为：94℃ 5min；94℃ 1min，60℃ 30s，72℃ 1min30s，30 个循环；72℃延伸 10min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳鉴定，其余产物进行胶回收。PRV TK胶回收产物送上海英俊生物技术有限公司进行序列测定。

1.2.4 PRV TK基因序列分析用DNAMAN软件对测得的此病料的PRV-TK基因核苷酸序列和推导出的氨基酸序列进行分析，并与GenBank中收录的伪狂犬病毒Bartha 株、FS170株、LA株、Min-A株、SA株、SL株的TK基因进行同源性分析。

2 结果

2.1 PCR鉴定用gE基因设计的引物进行PCR扩增，结果在850bp左右有一特异性条带（图1），与预期结果相符。结果表明所分离病毒为伪狂犬野毒。命名为YF株。

图1 M:Trans 2k Maker

2.2 PRV TK基因的扩增 PRV TK基因的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外观察可见一条大小约为1400bp的特异性条带，大小与预期相符（图2）。

图2 M:Trans 2k Maker

2.3 PRV TK基因序列分析经测序，扩增的此株TK基因片段长为1400bp,包含一个963bp的开放阅读框（ORF），编码320个氨基酸。用DANMAN将该ORF序列同GenBank上发表的其他毒株的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较分析（表1、2）。结果显示，此株与其他毒株核苷酸的同源性为98.4%-100%，而各毒株氨基酸的同源性为96.6%-100%，并且根据YF株氨基酸与其他株间的关系见进化树（表3）。

表1 核苷酸同源性比较

3 小结与分析

随着养猪生产向规模化、集约化方向发展，猪伪狂犬病在国内流行日趋广泛，临床症状各猪场表现不一，有的猪场轻微、病死率高；有的则出现典型的伪狂犬症状，哺乳仔猪的病死率高；母猪出现大规模流产。但引起母猪繁殖障碍的原因很多，除遗传因素外主要有病毒、布鲁氏杆菌、弓形虫、衣原体、钩端螺旋体引起，且其临床症状均表现流产、木乃伊死胎，不易确诊，所以实验室诊断是目前确诊病毒的最可靠方法。