林泽璇，杜江，王斌

(1.南方医科大学珠江医院儿科中心，广州 510000； 2.广州市炎症与免疫性疾病重点实验室，广州 510000)

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic ence-phalopathy，HIE)主要是指围生期窒息引起的脑损伤，可导致新生儿脑瘫、视听觉障碍、运动行为损伤，甚至死亡[1-2]。HIE在发达国家的发病率为1.5/1 000活产婴儿[3]，但在发展中国家的发病率可达26/1 000活产婴儿[4]。目前除常规支持疗法外,亚低温是治疗HIE安全有效的方法,但仅限于晚期早产儿或足月新生儿。为减少外源性凋亡的非靶向作用，达到有效的神经保护目的，有必要探索线粒体介导的内源性凋亡机制。HIE脑损伤包括两个基本病理生理事件，即缺氧和再灌注。再灌注导致氧化应激，从而介导脑损伤，这种脑损伤机制包括由小胶质细胞和星形胶质细胞介导的炎症反应、线粒体损伤、细胞凋亡以及自噬[5]。

在结构上，线粒体外膜含有线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)，参与调控线粒体膜的通透性[6]；线粒体内膜的膜蛋白复合物构成复合体Ⅰ～Ⅳ，称电子传递链，参与氧化磷酸化和质子梯度的形成[7-8]；线粒体基质是发生三羧酸循环的重要场所，参与能量的产生[9]；ATP合酶线性排列于线粒体嵴膜，促进ATP合成和MPTP的形成[10]。此外，线粒体外膜与内质网膜相互作用，形成类突触结构，称线粒体相关的内质网膜，Ca2+可经线粒体相关的内质网膜从内质网转移至线粒体[11]。线粒体是HIE新生儿炎症级联反应的起源和主要场所，HIE的发病率较高且后遗症严重，目前尚无针对性治疗的有效药物，现对HIE的线粒体相关机制和研究进展予以综述。

1 线粒体介导再灌注损伤的信号通路

新生儿缺氧缺血引起的脑损伤本质上是再灌注损伤。缺氧会导致机体尤其是大脑因血管收缩而缺血，此阶段机体活动减弱、能量生成减少，一旦机体获得氧气供应，血管舒张，大脑血供恢复发生氧化应激，导致再灌注损伤。在此阶段，机体释放兴奋性氨基酸、N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受体门控通道开放、细胞内Ca2+超载、线粒体功能障碍、线粒体通透性增加，其中线粒体是新生儿缺氧再灌注损伤的主要靶点，在细胞凋亡中起核心作用[12]。再灌注损伤后线粒体通透性增加，细胞凋亡相关蛋白从线粒体释放到细胞质中，这种现象在未成熟脑中尤为突出[12-13]。关于新生鼠的研究表明，再灌注损伤后，未成熟脑出现的细胞凋亡主要由线粒体介导，损伤因子激活细胞的促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路，导致线粒体功能障碍，从而诱导细胞凋亡，其中MAPK包括3条信号通路，即c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)、p38 MAPK[14]。近期研究发现，线粒体还可通过p53、聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose) polymerase-1，PARP-1]通路激活凋亡[15-16]。

1.1JNK信号通路 在缺氧缺血损伤后的再灌注损伤阶段，JNK通路激活，促凋亡蛋白Bid从胞质易位进入线粒体，线粒体释放大量细胞色素C和第2线粒体衍生的胱天蛋白酶激活剂(second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)，Smac进一步激活胱天蛋白酶(caspase)级联反应，诱导细胞凋亡[14]。早期动物研究发现，生理状态下Bax、Bim分别以14-3-3蛋白、dynein蛋白作为细胞质的锚定蛋白，并处于非活性状态；氧化应激时，JNK通过锚定蛋白的磷酸化，促使Bax、Bim从锚定蛋白解离，并以游离、活化的形式易位进入线粒体，从而触发线粒体凋亡信号通路[17]。JNK的激活还可通过c-Jun/激活蛋白-1介导的转录调控，形成激活蛋白-1转录因子复合物，增强caspase-9的表达，促进细胞凋亡[18]。线粒体JNK通路的磷酸化将促进神经炎症和细胞凋亡，抑制线粒体的JNK磷酸化有助于保持缺氧缺血损伤后线粒体的完整性[19]。

1.2ERK1/2通路 早期研究表明，ERK磷酸化激活可保护新生鼠的大脑[19]。在氧化应激早期，ERK1/2磷酸化激活并上调核因子E2相关因子2的表达[20]。核因子E2相关因子2是一种转录因子，活化的核因子E2相关因子2进入细胞核调控蛋白表达，发挥抗凋亡作用；在应激中晚期，ERK1/2持续激活，诱导Bax及caspase级联反应和线粒体功能障碍[20]。线粒体功能障碍主要包括两个主要事件，即线粒体膜通透性改变和随后发生的去极化，线粒体相关蛋白包括细胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子1及细胞凋亡诱导因子等，从线粒体释放入胞质，诱导凋亡[21]。

1.3p38 MAPK通路 新生儿再灌注损伤时，线粒体释放大量活性氧类(reactive oxygen species，ROS)，ROS是细胞凋亡的早期信号，直接参与caspase和MAPK的激活[22]，而ROS在持续激活p38 MAPK通路的同时，可抑制细胞生存通路磷脂酰肌醇-3-激酶/p85和蛋白激酶B的磷酸化，使原本存在于胞质的Bax易位到线粒体[23]，同时减少抗凋亡因子Bcl-2及Bcl-xL的表达[21]，Bax在线粒体外膜形成单聚体，MPTP开放，细胞色素C、凋亡诱导因子、内切酶G及Smac释放到胞质中，激活caspase级联反应[23]。

1.4p53通路 应激条件下，p53激活且表达增加，下游的p53 Ser15磷酸化，细胞周期蛋白B1、周期蛋白依赖性激酶1及细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C的表达下降，通过细胞周期检验点激酶1、ATM与Rad3相关蛋白激酶、磷酸化组蛋白H2AX等DNA损伤检查点诱导线粒体有丝分裂的G2/M期阻滞，使线粒体DNA碎裂分解；同时p53可上调促凋亡因子Bax的表达，下调抗凋亡因子Bcl-2的表达，促进细胞色素C释放，激活caspase级联反应，降低线粒体膜电位，诱导细胞凋亡[24-25]。对新生鼠的研究发现，缺氧缺血损伤后3 h或6 h，p53基因易位进入线粒体并在线粒体内蓄积，参与诱导线粒体介导的细胞凋亡，抑制p53可有效抑制细胞色素C和Smac/低等电点IAP直接结合蛋白进入细胞质中，并可在缺氧缺血损伤后24 h内几乎完全阻止caspase-3的激活，减少线粒体诱导的细胞凋亡，减少梗死体积，并改善功能和预后[26]。但近期对新生鼠的研究显示，p53通过线粒体膜间空间蛋白即含有卷曲螺旋结构域的蛋白质4易位进入线粒体，缺氧缺血损伤对p53通路相关基因的表达并无明显影响，因此p53通路是否参与新生大鼠缺氧缺血脑损伤的发生仍存在争议[27]。

1.5PARP-1通路 PARP-1是一种高度保守的核酶，通过与断裂的DNA单链或双链结合而促进碱基修复。氧化应激时大量DNA断裂，导致PARP-1过度活化，PARP-1通过调节转录因子ATF4，下调丝裂原活化的蛋白激酶磷酸酶-1的蛋白表达量，而丝裂原活化的蛋白激酶磷酸酶-1负反馈调节MAPK(主要是JNK和p38 MAPK)，并使其失活[15]。因此，丝裂原活化的蛋白激酶磷酸酶-1表达的下降可激活更多的JNK和p38 MAPK信号通路，破坏线粒体膜电位，增加ROS及细胞色素C的释放，促进细胞凋亡[16]。

2 线粒体释放ROS介导再灌注损伤的机制

2.1线粒体复合体Ⅰ是产生ROS的主要场所 复合体Ⅰ即NADH脱氢酶复合体，是线粒体氧化呼吸链的主要入口，位于呼吸链电子传递的起始部位。生理状态下，线粒体复合体Ⅰ为活跃的A型构象；当发生缺氧损伤时，线粒体功能受到抑制，复合体Ⅰ大多转变为休眠的D型构象(为生理状态下的8倍)，复合体Ⅰ失活。再灌注能迅速将D型构象转变为A型构象，使线粒体中电子传递链依赖的ROS释放增加，促进细胞氧化应激[7-8]。此外，缺氧缺血损伤时，线粒体有氧呼吸明显减少，琥珀酸大量蓄积，其水平在未成熟脑中可升高至原来的30倍[9]。再灌注早期，琥珀酸优先氧化，在线粒体膜电位存在的情况下，驱动线粒体反向电子传递，蓄积的琥珀酸的电子可向上游传递给复合体Ⅰ，在复合体Ⅰ生成超氧阴离子，大量ROS释放[8-9,22]。

2.2离子稳态失衡促使大量ROS产生 缺氧缺血损伤时，线粒体内的离子稳态失衡。生理状态下，Zn2+和Ca2+主要储存于内质网中[28-29]。钙超载是线粒体功能障碍的中心事件。氧化应激时，内质网释放Ca2+，钙调激酶Ⅱ磷酸化激活并增强线粒体内膜钙单向转运体的功能，介导线粒体对Ca2+的快速、高容量摄取[29]，缺氧缺血时机体释放谷氨酸增多，激活钙离子高渗透性的N-甲基天冬氨酸受体，大量Ca2+进入细胞[30]，导致Ca2+超载，MPTP形成并开放，线粒体肿胀、能量耗竭[11,29]。同时，细胞内Ca2+超载使丙酮酸脱氢酶磷酸化失活，丙酮酸无法进入三羧酸循环，只能经乳酸脱氢酶进入糖酵解，生成乳酸，促进细胞的能量衰竭[31]。

近期研究表明，ROS与Zn2+的水平在缺氧缺血过程中各有两个阶段的升高[28]。缺氧缺血初期，机体缓慢产生ROS，Zn2+经内质网的Zn2+转运体释放并被线粒体摄取，此时Zn2+的缓冲稳态机制仍存在，细胞损伤可逆；随着缺氧时间的延长，线粒体摄取的Zn2+过多，Zn2+超载，抑制电子传递链、激活MPTP，导致线粒体膜去极化、线粒体膜电位丧失、ROS释放量急剧增加且持续升高，导致细胞不可逆损伤；再灌注时，细胞内蓄积的Zn2+可激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶并与其相互作用，导致ROS爆发式增加，靶向细胞凋亡信号级联通路[28]。

总之，线粒体摄取的Ca2+、Zn2+过多，细胞内离子稳态失衡，导致线粒体膜通透性改变，MPTP不可逆开放，线粒体功能障碍，超载的离子从线粒体流出至胞质中，使大量ROS生成，激活氧化应激，导致再灌注损伤。

2.3线粒体释放的ROS导致细胞膜去极化 在新生鼠上模拟HIE的病理生理时发现，缺氧缺血损伤后线粒体释放大量ROS，ROS转化为H2O2后导致细胞膜去极化，细胞膜通透性增加将导致更多炎症物质释放，形成再灌注损伤的恶性循环[32-33]。线粒体摄取大量Ca2+，导致细胞外Ca2+水平降低，胞内ATP分解产生大量腺苷，腺苷随后通过核苷转运体释放到细胞外并激活A1受体，磷酸化激活JNK和p38 MAPK信号通路，GluA2胞吞增多、表达减少，导致突触抑制[34]、K+通道激活、细胞膜超极化、细胞放电率下降[35]，脑细胞损伤。此外，细胞外Ca2+水平降低，Ca2+依赖的胞吐等过程将被阻滞，电压门控Na+通道开放，胞外K+水平暂时性升高，导致电位爆发[35]。因Na+通道开放，神经元细胞膜明显去极化，导致阈值下降、振幅升高的动作电位，细胞膜兴奋性升高[30,35]。生理状态下细胞膜的K+通道被Mg2+等阻塞封锁，导致静息状态下膜电流很小，在缺氧缺血时细胞膜去极化，Mg2+的封锁作用解除后，N-甲基天冬氨酸受体激活并与谷氨酸结合，Ca2+通道打开，细胞膜电位爆发[36-37]。癫痫发作本质上是大脑神经元过度放电引起的症状，这可能是HIE易导致癫痫后遗症的机制。

3 以线粒体为靶点治疗HIE的药物研究进展

新生儿大脑易受氧化应激影响，这可能是因为缺氧缺血损伤后线粒体呈低代谢状态，且磷酸戊糖途径活性降低。大脑发育早期，星形胶质细胞中谷氨酸转运体较少，对谷氨酸的摄取能力较低，这可能是新生儿大脑对兴奋性毒性高度敏感的一个重要原因[38]。目前临床上尚无治疗HIE的有效药物，只能通过亚低温治疗改善症状，但疗效尚存在争议。一项关于新生儿轻度脑病的Meta分析发现，婴儿采用亚低温治疗的不良反应发生率为19.6%(11/56)，而普通护理不良反应发生率为19.7%(12/61)，风险比为1.11[39]。该研究认为目前的证据不足以推荐对患有轻度脑病的婴儿常规进行亚低温治疗，不能排除明显的益处或危害。此外，全身给药也存在药物利用率低、难以达到有效治疗浓度、毒副作用大等问题，因此有必要探索线粒体介导的内源性凋亡机制、寻找HIE的针对性治疗药物。

褪黑素、促红细胞生成素、干细胞治疗等也可作为HIE的治疗方法，但安全性及有效性尚存在争议。褪黑素具有抗氧化应激的作用，为亲脂性，可透过血脑屏障。有研究认为褪黑素对神经元代谢无保护作用，在缺氧缺血脑损伤后的早期阶段，所给剂量的褪黑素不能保护神经元线粒体[40]。一项关于HIE的Ⅱ期临床试验显示，促红细胞生成素治疗组中/重度脑损伤、皮质下损伤以及小脑损伤的发生率低于安慰剂组，认为大剂量促红细胞生成素(1 000 U/kg，静脉注射)联合亚低温治疗HIE可降低脑损伤的MRI评分，改善出生后1年的运动功能[41]。也有研究提出，亚低温及干细胞联合治疗可导致新生乳鼠长期运动认知障碍增加、脑损伤加重，并伴有内皮细胞活化、周围免疫细胞浸润增强、促炎细胞因子增加，生长因子表达降低，这可能是因为早期亚低温治疗改变了大脑微环境，调节了间充质干细胞的功能[42]。

缺氧损伤时机体启动的自噬可能有神经保护作用，抑制自噬可促进细胞色素C、活化的caspase-3和caspase-9表达，线粒体超氧化物增多，线粒体膜电位降低，加重线粒体功能障碍和细胞凋亡[32]。ROS的产生可激活大脑谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化物质并使其上调，提高神经元的存活率[43]。这可能是机体的自我保护机制。

缺氧缺血损伤后使用异氟醚可抑制MPTP开放，降低缺氧缺血损伤导致的长期空间学习和记忆功能障碍，发挥脑保护作用[6]；异氟醚可抑制再灌注初始阶段复合体Ⅰ依赖性线粒体呼吸的恢复，限制自由基释放，并减少琥珀酸依赖的H2O2的释放，减轻氧化应激，如同时应用机械通气，可改善脑循环，对脑再灌注损伤起保护作用[44]。抑制钙单向转运体或MPTP的形成，可通过阻断线粒体Ca2+超载，减少梗死体积，减轻脑损伤，不促进糖酵解，进而保护线粒体功能[29,31]。有研究表明，脑卒中时使用环孢霉素A治疗可上调DJ-1的表达，稳定MPTP，并使线粒体释放的细胞色素C减少[45]。线粒体复合体Ⅰ的构象变化是线粒体功能障碍的重要过程，抑制复合体Ⅰ活性或延缓复合体Ⅰ活性恢复可减轻脑损伤程度。有研究表明，在再灌注初始阶段给予线粒体靶向硝化剂，可延缓复合体Ⅰ构象从D型转变为A型，D型构象复合体Ⅰ酶不能驱动反向电子传递，ROS生成明显减少，氧化应激减轻，且不影响琥珀酸依赖的氧化呼吸链[7-8]。有研究显示，低剂量血红素可上调神经球蛋白的表达，减少细胞色素C释放，从而阻断内源性抗凋亡通路[46]。

4 小 结

线粒体是缺氧再灌注损伤的主要靶点，新生大鼠脑缺氧缺血损伤1 h后，糖酵解和星形胶质细胞线粒体代谢恢复，而神经元线粒体代谢严重受损，这强调了神经元线粒体的脆弱性，其可能成为神经保护治疗的新靶点[40]。目前HIE靶向治疗药物仍处于动物实验或临床试验阶段，如促红细胞生成素、褪黑素、干细胞等，但因作用靶点广泛、治疗机制尚未完全明确，可能具有较大的毒副作用。线粒体在HIE中起着至关重要的作用，能促进二次能量衰竭、驱动氧化应激，导致脑损伤。如能找到靶向线粒体的抑制剂，在减少氧化应激的同时不影响细胞的能量代谢，将有望改善HIE的预后。