刘 畅， 刘 飞， 舒丽琼， 钱 丹， 田 野， 蒲晓允

（陆军军医大学新桥医院检验科，重庆 400037 ）

在细胞生命的发展进程中，核酸分子、蛋白质等生物分子在遗传信息的传递及表达中发挥着至关重要的作用。已有大量的生物分子被确定为许多疾病诊断的潜在生物标志物。在疾病的预测、诊断及治疗中，实现对相关生物分子的精准、快速检测已成为研究者关注的热点。在疾病发生早期，与疾病相关的生物标志物均痕量存在于复杂的机体环境中，因此建立高特异性、高敏感性的检测技术是关键。随着材料学、生物信息学的发展，生物传感器技术已成为多学科交叉的新兴技术。目前，在众多生物传感检测系统中，适配体生物传感器以适配体作为新型的分子识别探针，与生物传感器结合，具有特异性好、制备简单、稳定、易于修饰等特点，在生物医学领域具有广阔的应用前景[1]。本文对适配体生物传感器在生物分子检测领域的应用作一综述。

1 核酸适配体概述

适配体是通过指数富集配基系统进化（systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX）技术从体外合成的单链寡核苷酸文库中反复筛选获得的DNA或RNA寡核苷酸单链[2]。这些单链寡核苷酸序列由20～80个碱基组成，空间结构复杂，能与多种生物分子结合，包括小分子物质、酶、多肽、金属离子、细胞等。

适配体在生物分析化学、蛋白质组学、临床医学、药物研发、基因调控及食品安全等领域已经成为重要的研究工具[3-5]。适配体在适配体传感器中作为分子特异性识别物质与检测靶分子结合，具有独特的优点。适配体作为DNA或RNA的寡核苷酸片段，其相对分子质量小，与作用分子结合的空间结构位阻较小，利于其他活性物质的修饰及固定。适配体作为寡核酸片段适用范围广，能与单链DNA结合，可以与金属离子、氨基酸、核苷酸、糖类、维生素等生物小分子及抗体、酶、生长因子等生物大分子结合，甚至还能与细菌、病毒、细胞等靶分子相互作用。

2 适配体生物传感器

目前，生物传感技术在核酸、蛋白质、病原菌、细胞等生物分子的快速检测中被广泛应用。生物传感器作为核酸适配体的重要应用领域，为众多研究者所关注。

适配体生物传感器是以DNA或RNA适配体作为感受器表面的识别元件，将适配体通过各种方法固定于电极表面，适配体与待测靶分子特异性结合后产生可识别的生物信号，进而通过换能装置将识别信号转换成可定量检测的电、光、色等化学信号的新型传感器。根据传感器检测信号的不同，适配体传感器可分为电化学适配体传感器、荧光适配体传感器、比色适配体传感器等。

3 适配体生物传感器在生物分子检测中的应用

3.1 适配体生物传感器在生物小分子检测中的应用

生物小分子包括氨基酸、糖类化合物、核苷酸、神经递质及激素在内的物质，是组成生物大分子的结构单元和维持生命正常机能的基础。这些生物小分子含量和活性与人体的健康密切相关，在生命体的新陈代谢、免疫维持、组织修复等方面发挥着重要的作用。多巴胺是一种广泛存在于中枢神经系统的神经递质，是肾上腺素及去甲肾上腺素合成的前体物质，参与调节人体的运动、记忆、情绪等生理功能。多巴胺紊乱会引起帕金森综合征、精神分裂等疾病。AZADBAKHT等[6]以纳米金修饰的聚乙烯亚胺功能化碳纳米管为捕获探针，将其固载于电极表面，结合上多巴胺-适配体检测探针，以亚甲基蓝（methylene blue，MB）为氧化还原探针，构建了电化学适配体传感器，实现了血清样本中多巴胺的高敏感性检测，线性范围为5～300 nmol/L，最低检测限为2.1 nmol/L。

腺苷是存在于机体细胞内外的一种内源性核苷，是三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成的中间产物，与细胞的代谢状态密切相关，腺苷可作为肿瘤的潜在血清敏感型标志物[7-9]，在肿瘤诊断及治疗效果评价中具有临床实用价值。WANG等[10]报道了一种“signal-off”的电化学适配体传感器，用于ATP的快速检测。传感器通过在电极表面修饰上与ATP适配体部分互补的DNA链，借助适配体上的G碱基结合大量的MB电活性物质。当目标待测物（ATP）出现后，适配体与之特异性结合，并从捕获探针DNA链上解离，使电极表面聚集的MB减少，从而产生减弱的电化学信号，从电化学信号减弱的强度实现ATP的定量测定。JIA等[11]在此研究基础上，改进并设计了双发卡DNA结构及插入法以增强电化学信号，构建了检测ATP的适配体传感器。他们首先设计了标记有MB的适配体与辅助DNA链互补的双发夹DNA探针，并固定于电极表面，由于每个双发卡DNA探针标记有2个MB，因此在电极表面可以检测到较强的电流信号。当待检样本中有ATP存在时，适配体与ATP结合，探针双发夹结构被破坏，适配体链末端的MB及辅助DNA链均脱离电极表面，产生明显降低的电化学信号，通过检测电流信号的降低，实现ATP的高灵敏检测，线性范围达到5～1 000 nmol/L。GAO等[12]报道了用于ATP检测的纳米金适配体比色传感器。他们设计了H1、H2 2条带有黏性末端的发夹结构探针，发夹探针通过黏性末端与纳米金结合，在一定盐浓度下，阻止了纳米金的聚集。在ATP存在的条件下，含有ATP适配体序列的H1发夹探针特异性识别靶分子，打开发夹结构。同时单链H1探针作为引发剂，与H2探针相互作用，进行杂交链式反应，从而脱离纳米金粒子表面，使纳米金粒子发生聚集，产生由红色到蓝色变化的颜色反应。构建的传感器操作简便，无需标记，最低检测限为1.0 nmol/L。

3.2 适配体生物传感器在肿瘤标志物检测中的应用

在肿瘤的发生、发展过程中，肿瘤细胞会合成并分泌与疾病密切相关的标志物。当肿瘤存在或发生时，这些肿瘤标志物在人体血液、体液或组织中的含量会发生异常改变。前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）是前列腺癌特异性的血清标志物。ZHAO等[13]以PSA为检测靶分子，构建了一种基于发夹探针诱导的目标循环及双金属催化信号放大的电化学适配体传感器。他们设计合成了PSA-适配体互补探针并自组装于磁性纳米粒子表面，构建了金-铂-亚甲基蓝（AuNPsplatinum-methylene blue，Au/Pt-PMB）纳米复合物标记的检测探针，同时将发夹结构的捕获探针固定于电极表面。当待测样本中存在PSA时，适配体会特异性识别并结合PSA，使适配体互补探针从双链DNA解离，并与电极表面的捕获探针结合，在辅助探针的作用下，引发DNA探针的循环扩增。标记有Au/Pt-PMB复合物的检测探针与捕获探针互补结合后，通过Au/Pt-PMB对H2O2的催化，高灵敏地检测PSA。构建的传感器线性范围宽，灵敏度高，检测线性为10 fg/mL～100 ng/mL，最低检测限为2.3 fg/mL，牛血清白蛋白、免疫球蛋白等物质对传感器的检测结果无明显干扰。JALALVAND等[14]报道了基于纳米金-碳60-壳聚糖-电解液-多壁碳纳米管（AuNPs-fullerene C60-chitosan-ionic liquid-multiwalled carbon，AuNPs-C60-CS-IL-MWCNTS）修饰的PSA-适配体丝网印刷电极，通过测定PSA与适配体特异性结合前后电极表面电化学阻抗值的变化，实现了样本中PSA的微型化定量检测，检测线性为1 pg/mL～ 200 ng/mL，最低检测限为0.5 pg/mL。

血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是一种参与肿瘤发生、发展的血管生长因子，与食道癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤密切相关。CHANG等[15]将纳米金结合分支链DNA扩增技术构建了比色适配体传感器。该技术通过扩增反应制备了DNA树枝状纳米结构的捕获探针，在纳米金促进盐诱导聚集作用下，信号级联放大，实现了对PDGF的高灵敏定量测定。ZHANG等[16]研制了一种基于H2O2酶功能化的网状DNA-铂纳米粒子（platinum nanoparticle，PtNP）信号放大的适配体电化学传感器，其方法是通过适配体DNA链的杂交结合，在电极表面自组装形成H2O2酶功能化的铂纳米笼，在六氨合釕[hexaammineruthenium（Ⅲ） chloride，RuHex]吸附PtNPs的协同催化作用下，极大地提高了RuHex的电化学检测信号。该研究进一步推进了适配体传感器在肿瘤标志物检测中的应用。

3.3 细胞因子的检测应用

细胞因子是由T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞刺激分泌的具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子在参与细胞免疫调节的过程中，与肿瘤的发生发展、炎症作用等密切相关。YIN等[17]报道了一种基于石墨烯-纳米金修饰电极，双酶催化信号放大的电化学适配体，用于细胞因子干扰素γ（interferon gamma，IFN-γ）的高灵敏检测。他们设计合成了捕获探针，与适配体互补形成双链，固载于石墨烯-纳米金修饰的电极表面。当待测样本中存在IFN-γ，适配体从捕获探针解离，与IFN-γ特异性识别并结合。在核酸外切酶RecJf的作用下，适配体被剪切，IFN-γ被重新释放，实现目标物循环的信号放大。以连接探针作为引发剂，电极表面的单链捕获探针与生物素标记的发夹探针进行杂交链式反应，使电极表面获得大量生物素标记的双链聚合物，通过与亲和素标记的辣根过氧化物酶结合，利用辣根过氧化物酶的催化作用完成IFN-γ的定量检测。YIN等[17]构建的传感器具有较好的选择性及稳定性，线性范围为5 pmol/mL～5 nmol/mL，最低检测限为2 pmol/L（信噪比=3），与酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELLSA）方法相比，回收率达91.3%～107.7%，2种方法的相对标准偏差为4.21%～5.54%。XIA等[18]构建了一种IFN-γ与溶菌酶（lysozyme，Lys）同步检测的“signal-off（或signal-on）”型电化学适配体传感器，他们设计合成了二茂铁（ferrocene，Fc）及MB标记的2种信号探针固定于金电极表面。2种信号探针能分别与IFN-γ及Lys的适配体互补结合，形成双链DNA聚合物。当待测样本中存在IFN-γ或Lys时，适配体会特异性识别靶分子，从双链DNA聚合物解离，进而使固定于电极表面的检测探针发生构型改变，使标记的电活性物质Fc及MB远离或靠近电极，产生一组强度相反的电化学信号，实现2种生物分子的同步检测。该传感器检测IFN-γ及Lys的最低检测限分别为1.14×10-3nmol/L及 0.016 4 nmol/L。

3.4 适配体生物传感器在病原微生物检测中的应用

病原微生物包括细菌、病毒、支原体、衣原体等。目前，临床上常规的病原微生物检测技术为分离培养法，再通过一系列生化实验对分离菌进行鉴定。但这种分离培养的鉴定方法操作复杂，耗时长（5～7 d），难以满足临床对感染性疾病快速、及时的诊断和治疗的要求。

目前，采用适配体筛选技术针对细菌表面特定的纯化蛋白、细胞裂解蛋白等进行筛选，可获得适配体的细菌主要有沙门菌、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等。YAN等[19]利用甲型副伤寒沙门菌适配体高特异的识别特性，以5-羧基荧光素（5-carboxyfluorescein，FAM）与SYBR Green I作为荧光分子，氧化石墨烯（graphenoxid，GO）作为荧光淬灭剂，构建了检测肠炎沙门菌的适配体传感器。当检测体系中无待检病原菌时，适配体荧光探针被吸附到GO表面，使荧光被淬灭。当检测体系中出现待检菌后，沙门菌与适配体特异性识别并与之结合，适配体探针从GO上释放出来，产生荧光信号。在Klenow酶的作用下，与延伸探针3'端双链的适配体结合，同时置换下目标菌，实现目标物的循环利用使信号放大，同时结合FAM和核苷酸胶体染液协同信号放大，使荧光增强，极大地提高了检测敏感性，使敏感性达3×102CFU/mL。HASAN等[20]利用全菌体沙门菌适配体高特异的识别特性，将氨基修饰的DNA适配体固定在多壁碳纳米管-ITO电极表面，通过检测适配体和菌体结合前后电流峰值的变化，实现对鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌的高灵敏检测，在优化的实验条件下，最低检测限分别为55和67 CFU/mL。

目前，针对病毒表面不同的结构或非结构蛋白筛选出来的病毒适配体有肝炎病毒适配体、流感病毒适配体等。随着适配体传感器技术的发展，新的检测方法已应用于病毒的检测。GHANBARI等[21]报道了一种操作简便、响应快速的电化学阻抗型适配体传感器，可用于丙型肝炎病毒的检测。该适配体传感器采用石墨烯量子点修饰玻碳电极，以固定于电极表面的丙型肝炎病毒核心蛋白适配体捕获目标病毒，通过电极表面电化学阻抗值的变化实现对丙型肝炎病毒的检测，最低检测限为3.3 pg/mL。XI等[22]利用乙型肝炎病毒表面抗原特异性适配体，构建了一种电化学发光的新型适配体传感器。该传感器通过构建纳米金/四氧化三铁/二氧化硅适配体磁性探针，通过检测电化学发光信号，定量测定血清乙型肝炎病毒表面抗原，与传统的ELLSA相比，检测敏感性得到了极大提高，最低检测限为0.05 ng/mL。

3.5 适配体生物传感器在细胞检测中的应用

现阶段外周血中循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）的检测对于乳腺癌、白血病等的诊断、治疗和预后评价具有十分重要的意义[23-25]。细胞核酸适配体为适配体传感器在肿瘤细胞检测中的应用提供了新的思路和有效方法。SHENG等[26]的研究结果显示，乳腺癌细胞适配体探针与MCF-7细胞特异性结合后可引发构型变化，暴露黏性末端，进而与链霉素、亲和素、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）形成杂交双链，在聚合酶辅助下经过滚环扩增，通过HRP催化导电聚苯胺，产生急剧增大的电流信号，实现对MCF-7细胞的高灵敏检测。YU等[27]报道了一种用于白血病细胞K562检测的适配体传感器新方法。该传感器利用适配体捕获K562细胞至电极表面，通过生物素标记的刀豆蛋白A探针与K562细胞结合，然后与链酶亲和素标记的碱性磷酸酶结合，通过碱性磷酸酶对底物α-萘酚（alpha-naphthol，α-NP）的催化产生明显的电化学活性信号，从而实现对K562细胞的高灵敏检测。

4 展望

将适配体作为新型的分子识别元件与生物传感技术结合，构建的适配体生物传感器结合了适配体高特异性、亲和力、稳定性的优势，同时具备生物传感器响应快速、便捷、灵敏、成本低廉的特点。基于适配体技术的电化学、光学等生物传感器已被广泛应用于靶向检测、疾病诊断、药物筛选等领域中，实现对多种生物分子的痕量超敏检测，展现出巨大的发展潜力及广阔的应用前景。

目前，市场上还没有将核酸适配体作为检测手段的产品上市，适配体生物传感器应用于生物检测还存在不足，主要在于：（1）基于多种生物分子同步检测的适配体生物传感器模型较少。由于适配体筛选技术的高度特异性，限制了作为分子识别元件的适配体探针实现多种生物分子的快速检测。因此实现多种生物分子的高通量快速检测是适配体传感器发展的重要方向。（2）针对不同生物分子，如细菌、细胞、蛋白质等的适配体种类有限。开发更为简单、精准的适配体筛选技术将推动适配体传感器的快速发展。（3）以建立非标记适配体传感器技术为研究方向。现阶段一些荧光、电活性物质等对适配体的标记均会对适配体的特异性及靶分子的亲和性产生影响，因此，非标记适配体传感器技术的研究已成为众多学者关注的重点。

综上所述，随着适配体筛选技术、生物传感技术的飞速发展，基于适配体的生物传感器检测方法在生物分子检测领域将会有更广阔的发展及应用潜力。