黄华毅 于地美 黄咏槐 黄焕华 田呈明

(1.广东省森林培育与保护利用重点实验室/广东省林业科学研究院，广东 广州 510520；2.中国国家知识产权局专利局专利审查合作中心，北京 100083；3.北京林业大学/省部共建森林培育与保护教育部重点实验室，北京 100083)

植物病原细菌是引起植物病害发生的重要病原菌之一，能引起多种植物病害且危害寄主广泛[1]。欧美杨细菌性溃疡病菌（Lonsdalea quercina）是一种破坏性极强的病原细菌，能导致杨树侧枝和主干发生溃疡腐烂，严重的导致侧枝甚至整株死亡[2]。丁香假单胞菌（Pseudomonassyringae）是猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌，可引起猕猴桃茎干和藤形成溃疡，阻断植株养分的正常运输，最终导致植株整株枯死[3]。软腐欧文氏菌（Erwiniacarotovora）是一种引起白菜发生软腐病的病原菌[4]。核桃黄极毛杆菌（Xanthomonasjuglandis）引起的核桃细菌性褐斑病主要危害核桃的幼果、嫩梢和叶片，尤以幼果危害最为严重[5]。目前，控制植物病原细菌感染和传播主要还是应用化学药剂，然而，长期且过度使用耐降解的化学药剂会导致环境污染、生态破坏，同时会诱导植物病原菌产生抗性[6]。因此，开发和应用环境友好型的替代防治方法以减少对化学药剂的依赖一直是植物保护领域的研究热点。在众多的替代防治方法当中，生物防治无疑是一种富有前景的防治方法，使用拮抗微生物可以有效控制植物病原菌，同时对环境和生态也更加安全[7]。

菌株XZQ-20 是从黑杨（Populus nigra）根际土壤中分离得到的一株拮抗细菌，本研究测定了菌株XZQ-20 及其无菌培养滤液对4 种植物病原细菌的拮抗活性，并对其产生细胞壁裂解酶的特性进行测定。最后，基于传统方法和分子生物学的手段对菌株XZQ-20 进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试拮抗细菌XZQ-20 菌株分离自黑杨根际土壤。供试4 种靶标植物病原细菌菌株：欧美杨细菌性溃疡病菌、丁香假单胞菌、软腐欧文氏菌和核桃黄极毛杆菌，用于拮抗菌株XZQ-20 的拮抗活性的测定。

1.2 培养基

LB 培养基：用于细菌菌株的平板培养和斜面保存；LB 液体培养基：用于细菌菌株菌液的制备；MLM 培养基（葡萄糖20 g，酵母浸粉2 g，谷氨酸5 g,KH2PO42 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NH4Cl 0.835 g,CuSO40.16 mg,(NH4)2SO41 g,NaNO21.077 g,NaCl 3.083 g,KCl 0.5 g,FeSO40.15 mg，MnSO4·H2O 0.45 mg,pH 7.0）：用于拮抗细菌XZQ-20 的发酵培养。

1.3 种子液的制备

挑取活化后的菌株XZQ-20 或植物病原细菌的单菌落，接种至装有100 mL 的LB 液体培养基的三角瓶（规格250 mL）中，于30°C，200 r·min-1的条件下震荡培养24 h 获得种子液，将种子液浓度调整为1.0 × 107cfu·mL-1后备用。

1.4 菌株XZQ-20 无菌培养滤液的制备

事先制备好菌株XZQ-20 的种子液，按照1%（v·v-1）的接种量接种至装有100 mL MLM 培养基的三角瓶（规格500 mL）中，于30 °C、200 r·min-1条件下振荡培养5 d。然后在4 °C、12 000 r·min-1的条件下离心30 min 后收集上清液，再用0.45 µm 微孔滤膜过滤，得到菌株XZQ-20 的无菌培养滤液。

1.5 菌株XZQ-20 对植物病原细菌的拮抗活性

事先制备好的植物病原细菌种子液，按1:10（v·v-1）的比例分别与加热冷却至45-50°C 的LB固体培养基混匀，倒平板（规格9 cm），待平板冷却凝固后，挑取活化后的菌株XZQ-20 的单菌落接种于混合了植物病原细菌的LB 平板上，接种点距平板中心2.5 cm，每个培养皿均匀接种3 个点，在30°C 培养箱中培养3 d 后测量抑菌圈直径。每个实验重复3 次。

1.6 菌株XZQ-20 的无菌培养滤液对植物病原细菌的拮抗活性

菌株XZQ-20 无菌培养滤液的拮抗活性的测定采用滤纸片法[8]。事先制备好的植物病原细菌种子液，按1:10（v·v-1）的比例分别与加热冷却至45-50°C 的LB 固体培养基混匀，倒平板（规格9 cm），待平板冷却凝固后，将直径为6 mm 的无菌滤纸片置于平板上，距平板中心2.5 cm，每个平板均匀放置3 个无菌滤纸片。采取逐滴滴加的方法往不同滤纸片上分别滴加40 μL 的无菌培养滤液，以滴加等量的无菌水作为对照组，在30°C培养箱中培养3 d 后测量抑菌圈直径。每个实验重复3 次。

1.7 菌株XZQ-20 产细胞壁裂解酶特性测定

菌株XZQ-20 产β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶和脂酶的特性测定分别采用文献[9-12]中的方法。

1.8 菌株XZQ-20 的鉴定

1.8.1 形态及生理生化指标测定 参照文献[6,12-13]的方法对菌株的形态和生理生化特征进行测定，包括细菌形状、大小、革兰氏染色、接触酶、淀粉水解、明胶液化等指标。

1.8.2 系统发育分析 采用菌落PCR 法扩增16S rDNA[14]：挑取单菌落至装有500 μL 无菌去离子水的EP 管中，100 °C 煮沸10 min 后，12 000 r·min-1、2 min 离心取上清液，即为菌株的基因组DNA。以提取的菌株基因组DNA 为模板，利用引物fD1：5’-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，rD1：5’-CCCGGGATCCAAG-CTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3’[15]，进行PCR 扩增。扩增体系为25 μL，含有2×ES Taq MasterMix 12.5 μL、引物fD1 和rD1 各1 μL、DNA 模 板1 μL，ddH2O 补足至25 μL。扩增条件：94 °C 3 min；94 °C 1 min，52 °C 1 min，72 °C 2 min，30 个循环；72 °C 10 min。引物合成和测序由英潍捷基(北京)贸易有限公司完成。采用BLAST 方法在GenBank 数据库中进行相似性搜索和同源性比较，采用ClustalX 1.8 进行序列匹配分析，通过MEGA 5.0 软件，采用Neighbor-Joining法构建系统发育，用Bootstrap (重复抽样1 000 次)分析评估树的稳定性。

2 结果与分析

2.1 菌株XZQ-20 对植物病原细菌的拮抗活性

培养3 d 后，菌株XZQ-20 对4 种植物病原细菌均表现出了较好的拮抗活性，其抑制欧美杨细菌性溃疡病菌、丁香假单胞菌、软腐欧文氏菌和黄极毛杆菌形成的抑菌圈直径分别达到（11.75±1.06）mm，（13.3±2.26）mm，（16.75±0.07）mm 和（7.55±1.06）mm（图1）。菌株XZQ-20 已被保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏号：CGMCC NO.12556）。

图1 菌株XZQ-20 活菌体对植物病原细菌的拮抗活性Figure 1 Antagonistic activities of viable bacteria of strain XZQ-20 against plant pathogenic bacteria

2.2 菌株XZQ-20 无菌培养滤液对植物病原细菌的拮抗活性

不同种类的4 种植物病原细菌（L.quercina,P.syringae,E.carotovora和X.juglandis）用于测定菌株XZQ-20 的无菌培养滤液的拮抗活性，结果显示培养3 d 后抑菌圈直径分别达到（8.18±0.75）mm，（7.63±0.88）mm，（8.03±0.93）mm 和（8.60±0.53）mm（图2）。

图2 菌株XZQ-20 的无菌培养滤液对植物病原细菌的拮抗活性Figure 2 Antagonistic activities of sterile culture filtrate of strain XZQ-20 against plant pathogenic bacteria

2.3 菌株XZQ-20 产细胞壁裂解酶特性

菌株XZQ-20 产5 种细胞壁裂解酶特性测定结果表明，在培养了4 d 后，只有脱脂牛奶培养基平板上的XZQ-20 菌体周围产生了透明圈（图3），而其他裂解酶测定平板中菌体周围未见透明圈或晕圈出现，表明菌株XZQ-20 能产生蛋白酶。

图3 菌株XZQ-20 产蛋白酶活性Figure 3 The protease activity of strain XZQ-20

2.4 菌株XZQ-20 的鉴定

2.4.1 形态学特征及生理生化特性 菌株XZQ-20在LB 平板上呈乳白色，不透明，菌落圆形、光滑，边缘隆起、完整，菌体粘稠（图 4 A）。菌体为杆状，大小约0.80～2.03 μm×2.75～7.49 μm，有芽孢，具鞭毛，革兰氏阳性菌（图 4 B）。兼性厌氧型，能够利用葡萄糖、D-木糖，甘露醇和柠檬酸盐，能水解葡萄糖产气，明胶液化，硝酸盐还原、硫化氢反应、氧化酶反应、卵磷脂酶活性、淀粉水解均呈阳性，而Voges-Proskauer 反应，吲哚反应，甲基红反应和苯丙氨酸脱氨酶活性均呈阴性。菌株能在温度范围10～41°C，pH 范围4～8和NaCl 浓度范围0.2%～3%之间生长（表 1）。根据形态学特征和生理生化特性将菌株XZQ-20 初步鉴定为深层类芽孢杆菌（Paenibacillus profundus）。2.4.2 16S rDNA 序列测定及分析 菌株XZQ-20的16S rDNA PCR 扩增得到一段大小为1 481 bp 的基因片段，系统发育分析（图5）结果显示，菌株XZQ-20 与P.profundusSl 79（AB712351）接近。综合菌株XZQ-20 的形态学特征、生理生化特性及16S rDNA 序列分析结果，最终将菌株XZQ-20鉴定为深层类芽孢杆菌。

表1 菌株XZQ-20 的生理生化特性Table 1 Physiology-biochemical characteristics of strain XZQ-20

图4 菌株XZQ-20 的菌落形态（A）和革兰氏染色（B）Figure 4 Colony morphology (A) and gram staining (B) of strain XZQ-20

图5 菌株XZQ-20 16S rDNA 序列的系统发育树Figure 5 Phylogenetic tree of strain XZQ-20 based on 16S rDNA sequence analysis

3 结论与讨论

类芽孢杆菌属（Paenibacillus）是最为重要的生物防治菌株资源之一，能广泛且有效地拮抗植物病原真菌和植物病原细菌。从辣椒（Capsicum annuum）田土壤中分离得到一株爱媛类芽孢杆菌（P.ehimensis）KWN38 能有效抑制立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的生长[7]。多粘类芽孢杆菌（P.polymyxa）CF05 对引起铁皮石斛（dendrobium officinalis）叶斑病的萎蔫短小杆菌（Curtobacterium flaccumfaciens）具有较高的拮抗活性[16]。在本研究中，分离自黑杨根际土壤中的菌株XZQ-20 被鉴定为深层类芽孢杆菌（P.profundus），其对欧美杨细菌性溃疡病菌、丁香假单胞菌、软腐欧文氏菌和黄极毛杆菌均表现出了较好的拮抗活性。由此看出，菌株XZQ-20具有开发成控制植物病原细菌引起的植物病害的生防菌剂的潜力。

大量的研究报道表明类芽孢杆菌属的细菌能产生不同种类的拮抗活性物质，包括脂肽类、蛋白类和挥发性气体等，这些拮抗活性物质具有较广的抑菌谱。从爱媛类芽孢杆菌KWN38 的无菌培养滤液中提取的粗蛋白和丁醇提取物均能破坏立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和辣椒疫霉菌的菌丝，此外，菌株KWN38 产生的挥发性气体也具有拮抗活性，同时还具有较强的几丁质酶、纤维素酶、葡聚糖酶和蛋白酶活性[7]。多粘类芽孢杆菌HKA-15 产生的抑菌脂肽能有效抑制野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris) M-5 的生长[17]。多粘类芽孢杆菌JSa-9 产生的拮抗蛋白表现出了较广的拮抗细菌和真菌的活性[18]。在本研究中，菌株XZQ-20 的无菌培养滤液表现出了较强的拮抗活性，这说明在菌株XZQ-20 的无菌培养滤液中存在着拮抗活性物质。此外，还发现菌株XZQ-20 能产蛋白酶，而产生的蛋白酶可能会破坏病原细菌的细胞壁结构，这也有可能是菌株XZQ-20 对不同种类的植物病原细菌均表现出拮抗活性的原因之一。

本研究结果表明菌株XZQ-20 是一株具有较强拮抗活性的细菌菌株，其活菌体和无菌培养滤液均能有效抑制多种病原细菌的生长。此外XZQ-20 还能产生蛋白酶。最后，结合形态学特征、生理生化特性和16S rDNA 序列分析，将拮抗菌株XZQ-20 鉴定为深层类芽孢杆菌。综上所述，拮抗菌株XZQ-20 是一株潜在的植物病原细菌的生防菌剂。