于慧辉 詹延霞 季丽莉 李 炀 孙丽华 程韵枫， 化范例△

（1复旦大学附属金山医院血液科 上海 201508；2复旦大学附属中山医院青浦分院血液科 上海 201700；3复旦大学附属中山医院血液科 上海 200032）

原发性免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）是临床常见的获得性自身免疫性出血性疾病，由于免疫紊乱导致血小板及巨核细胞破坏增加和/或生成减少。原发性ITP患者体内存在多种免疫细胞亚群数量和功能异常［1］，Th1/Th2显著失衡，目前公认原发性ITP为Th1优势自身免疫性疾病［2］。部分B细胞可以通过分泌IL-10而影响T细胞亚群（如Th1、Th17等）的分化和功能，其中CD5+B细胞是产生IL-10的重 要B细胞 亚群［3-4］，多种具有免疫调节功能的B细胞亚群都表达CD5分子标志物［5-7］。我们发现原发性ITP患者CD5+B细胞存在数量及分泌IL-10能力的异常［8-9］，提示在原发性ITP患者中CD5+B细胞对T细胞亚群的免疫调节功能可能存在缺陷。原发性ITP的一线治疗药物为糖皮质激素，首选大剂量地塞米松（highdose dexamethasone，HD-DXM）冲击治疗［10］。本研究通过观察原发性ITP患者CD5+B细胞对CD4+T细胞分泌Th1和Th2型代表性细胞因子IFN-γ 和IL-4的调节作用，以及经过HD-DXM治疗后CD5+B细胞免疫调节功能的变化，探讨CD5+B细胞在原发性ITP患者Th1/Th2失衡中的作用。

资料和方法

研究对象所有研究对象均符合《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识（2016年版）》［11］的诊断标准。收集2018年2月至6月复旦大学附属中山医院青浦分院血液科病房ITP患者共5例（男1例、女4例），中位年龄49（35～62）岁。招募健康对照者5例（男2例、女3例），中位年龄35（28～46）岁。本研究经复旦大学附属中山医院青浦分院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

HD-DXM冲击治疗方案患者起始血小板计数＜30×109/L和/或有出血表现，接受HD-DXM冲击治疗：口服地塞米松40 mg/d×4天，重症患者同时给予静脉注射丙种球蛋白0.4 g·kg−1·d−1×5天和/或血小板输注和/或重组人血小板生成素；4天后停药，若血小板稳定，则不再用药；若血小板下降至＜50×109/L，则重复给药1次，然后以泼尼松15 mg/d维持。疗效评估参照文献［11］。

淋巴细胞分选ITP患者接受HD-DXM治疗前、后均采集外周静脉血20 mL，EDTA-K2抗凝；健康对照者采集外周静脉血20 mL。采用Ficoll密度梯度离心法获得外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。分选CD4+T细胞：1×107PBMC重悬于80 μL分选缓冲液中，加入20 μL CD4磁珠，置于4 ℃冰箱孵育15 min；洗涤重悬后过柱，获得阳性细胞（纯度＞99%）。分选CD19+CD5+B细胞和CD19+CD5-B细胞：1×107PBMC重悬于80 μL分选缓冲液中，加入20 μL CD19磁珠，置于4 ℃冰箱孵育15 min，后10 min加入CD5-Biotin抗体10 μL；洗涤后过柱，分选获得CD19+B细胞；1 mL CD19+细胞中加入20 μL酶切试剂，4 ℃孵育10 min，洗涤后重悬于50 μL缓冲液；加入30 μL终止液；加入20 μL Biotin磁珠，4 ℃孵育15 min；洗涤重悬后过柱，分选获得CD19+CD5+B细胞（纯度＞90%），其余为CD19+CD5-B细胞（纯度＞98%）。

淋巴细胞共培养CD4+T细胞（2×105/mL）与完全RPMI 1640培养基混合，接种于预包被CD3 mAb的96孔培养板，在2.5 μg/mL CD28 mAb和10 ng/mL IL-2的条件下，磁珠纯化出的CD19+CD5+B细胞或CD19+CD5−B细胞与CD4+T细胞按1∶9、1∶5、1∶3、1∶1，混合培养72 h或144 h。

ELISA检测IFN-γ 和IL-4水平取上述细胞共培养上清，按ELISA试剂盒说明书检测IFN-γ 和IL-4水平，每个样本和标准品均设3个复孔，酶标仪读取波长450 nm处的吸光度（D）值，绘制标准曲线，计算IFN-γ 和IL-4含 量。所用ELISA试剂盒IFN-γ 和IL-4的最低检测浓度分别为5 pg/mL和0.5 pg/mL。

统计学分析运用SPSS 16.0和GraphPad Prism 7统计软件进行数据分析。计量资料以表示，多组间计量资料比较采用双因素ANOVA检验。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

结 果

健康对照组CD5+B细胞对CD4+T细胞分泌IFN-γ的影响共培养72 h，健康对照组CD5+B细胞与CD4+T细胞比例在1∶3时，CD4+T细胞分泌IFN-γ浓度明显下降，与T细胞单独培养相比差异有统计学意义［（2 427.99±632.62）pg/mLvs.（1 109.25±338.10）pg/mL，P=0.001 2］。CD5+B细胞与CD4+T细 胞比例增加至1∶1时，CD4+T细胞分泌IFN-γ 浓度下降至（395.22±136.54）pg/mL（P＜0.001）。共培养144 h得到相似的结果，但培养上清液中IFN-γ 浓度较共培养72 h高出数倍。

共培养72 h，各浓度梯度下CD5CD5−BB细胞对CD4+T细胞培养上清液中IFN-γ 浓度均未见明显影响（P均＞0.05）；当CD5-B细胞与CD4+T细胞比例增加至1∶1时，IFN-γ 浓度有下降趋势，但差异无统计学意义。共培养144 h，CD5−B细胞与CD4+T细胞比例为1∶9时表现为促进IFN-γ的 分泌，而B与T细胞比例增加至1∶3时对IFN-γ的分泌才产生抑制作用，较T细胞单独培养时IFN-γ浓度显著下降（P均＜0.01，图1、表1）。

表1 健康对照组CD5+/CD5-B细胞与CD4+T细胞共培养上清液中IFN-γ 浓度Tab1 The concentration of IFN-γ in supernatant of CD4+T cells cocultured with CD5+/CD5-B cells in healthy control group ［（），pg/mL］

表1 健康对照组CD5+/CD5-B细胞与CD4+T细胞共培养上清液中IFN-γ 浓度Tab1 The concentration of IFN-γ in supernatant of CD4+T cells cocultured with CD5+/CD5-B cells in healthy control group ［（），pg/mL］

（1）vs.T cell culture alone，P＜0.01.T：T cell；B：B cell.

ITP患者CD5+B细胞对CD4+T细胞分泌IFN-γ的影响共培养72 h，ITP患者CD5+B细胞与CD4+T细胞比例增至3∶1时，较T细胞单独培养时IFN-γ的分泌显著下降［（3 060.02±493.98）pg/mLvs.（1 769.45±634.73）pg/mL，P=0.000 3］。共培养144 h，ITP患者CD5+B细胞有轻度抑制CD4+T细胞分泌IFN-γ的趋势，但差异无统计学意义。

共培养72 h，ITP患者CD5−B细胞与CD4+T细胞比例为1∶1时，CD5-B细胞促进CD4+T细胞分泌IFN-γ，与T细胞单独培养相比差异有统计学意义（P=0.029 1）。共培养144 h，ITP患者CD5−B细胞对CD4+T细胞分泌IFN-γ几乎没有影响（P均＞0.05，图1、表2）。

表2 原发性ITP患者HD-DXM治疗前CD5+和CD5-B细胞与CD4+T细胞共培养上清液中IFN-γ 浓度Tab 2 The concentration of IFN-γ in supernatant of CD4+T cells cocultured with CD5+/CD5-B cellsof primary ITP patients before HD-DXM treatment ［（），pg/mL］

表2 原发性ITP患者HD-DXM治疗前CD5+和CD5-B细胞与CD4+T细胞共培养上清液中IFN-γ 浓度Tab 2 The concentration of IFN-γ in supernatant of CD4+T cells cocultured with CD5+/CD5-B cellsof primary ITP patients before HD-DXM treatment ［（），pg/mL］

（1）vs.T cell culture alone，（1）P＜0.05；（2）P＜0.01.T cell；B：B cell.

ITP患者HD-DXM治疗后CD5+B细胞对CD4+T细胞分泌IFN-γ的影响经HD-DXM治疗后ITP患者均获得完全或部分反应。共培养72 h，CD5+B细胞与CD4+T细胞比例为1∶1时，即表现出对CD4+T细胞分泌IFN-γ的抑制作用［（3 600.02±838.00）pg/mLvs.（1 157.97±383.20）pg/mL，P＜0.000 1］；当比例增加至3∶1时，CD4+T细胞分泌IFN-γ 浓度进一步下降至（829.67±314.25）pg/mL（P＜0.000 1）。共培养144 h的结果同样显示，经过HD-DXM有效治疗后，CD5+B细胞与CD4+T细胞比例 为1∶3时，表 现出对CD4+T细胞 分泌IFN-γ的抑制作用［（11 543.53±3 541.90）pg/mLvs.（5 102.81±1 734.33）pg/mL，P=0.002 9］；当比例增至1∶1和3∶1时，CD4+T细胞分泌IFN-γ的浓度随着B∶T细胞比例的增加进一步下降（P均＜0.000 1，表3）。

表3 原发性ITP患者HD-DXM治疗后CD5+B细胞对CD4+T细胞分泌IFN-γ的影响Tab 3 The concentration of IFN-γ in supernatant of CD4+Tcells cocultured with CD5+B cells of primary ITP patients after HD-DXM treatment ［（），pg/mL］

表3 原发性ITP患者HD-DXM治疗后CD5+B细胞对CD4+T细胞分泌IFN-γ的影响Tab 3 The concentration of IFN-γ in supernatant of CD4+Tcells cocultured with CD5+B cells of primary ITP patients after HD-DXM treatment ［（），pg/mL］

（1）vs.T cell culture alone，P＜0.01.T：T cell；B：B cell.

健康对照者及ITP患者的CD5+B细胞对CD4+T细胞分泌IL-4的影响在健康对照者和ITP患者中，CD5+B细胞以不同比例与CD4+T细胞共培养，无论72 h还是144 h，培养上清中IL-4的浓度变化与T细胞单独培养时比较，差异均无统计学意义。CD5-B细胞以不同比例与CD4+T细胞共培养，同样对IL-4的浓度无明显影响。

讨 论

CD5+B细胞具有分泌IL-10的能力，其免疫调节作用已经在动物实验中得到证实：体外诱导扩增的CD5+B细胞回输小鼠体内可以缓解实验性变态反应性脑脊髓炎疾病，而CD5-B细胞则不具备这种免疫调节功能［12］。本研究证实，健康对照组共培养72 h时CD5+B细胞具有抑制CD4+T细胞分泌IFN-γ的作用，提示CD5+B细胞影响Th1细胞亚群的细胞因子分泌，并在维持Th1/Th2平衡中起到重要作用。

我们发现在原发性ITP患者中CD5+B细胞存在数量及分泌IL-10能力的异常［8-9］，这提示在ITP患者中CD5+B细胞免疫调节功能可能存在缺陷。本研究发现，相较于健康对照组，CD5+B细胞对CD4+T细胞分泌IFN-γ（Th1型代表性细胞因子）有显著抑制作用，ITP患者中CD5+B细胞抑制IFN-γ分泌的能力明显受损，CD5+B细胞在更高的比例下才表现出对CD4+T细胞分泌IFN-γ的抑制作用，而且在相同的B：T细胞比例下，IFN-γ 分泌受抑制的程度远低于健康对照组。说明在ITP患者中CD5+B细胞调节CD4+T细胞分泌IFN-γ的功能存在缺陷。CD5+B细胞主要通过分泌IL-10发挥免疫抑制功能，本研究结果也与我们之前发现的ITP患者CD5+B细胞存在分泌IL-10能力异常相一致。B细胞分泌IL-10主要由Toll样受体及其下游的MyD88通路所介导，针对ITP患者CD5+B细胞，我们运用PCR Array方法对TLRs/MyD88信号传导通路中的相关分子进行初步探索，筛选出一些重要的差异表达分子，如FOS、JUN、IRF3等［13］，为后续机制研究提供了方向。

另一方面，健康对照者和原发性ITP患者的CD5+B细胞对Th2型代表性细胞因子IL-4的分泌均无明显影响。CD5+B细胞可以下调Th1/Th2型细胞因子的比例，但在ITP患者中由于CD5+B细胞抑制IFN-γ 分泌的能力明显受损，可能造成Th1/Th2失衡和Th1型细胞因子优势。ITP是一种典型的Th1优势的自身免疫性疾病，Th1/Th2失衡在ITP的发病机制中起到重要作用［14-16］。本研究结果提示，CD5+B细胞的免疫调节功能缺陷参与了ITP患者形成Th1优势和Th1/Th2失衡的过程。

HD-DXM治疗疗效好、疗程短、不良反应小，故推荐作为ITP的一线治疗［10］，但其作用机制尚不完全清楚。与治疗前相比，在HD-DXM治疗有效的ITP患者中观察到Th1/Th2失衡可被纠正［17］及Treg数量增加［18］等免疫细胞和细胞因子的变化。本课题组前期研究发现ITP患者CD5+B细胞的IL-10分泌障碍可以被HD-DXM修复［8］。本研究进一步发现，患者接受HD-DXM治疗后，CD5+B细胞抑制IFN-γ 分泌的能力部分恢复，提示CD5+B细胞免疫调节功能的恢复可能也是HD-DXM的作用机制之一。功能部分恢复的CD5+B细胞对IFN-γ 分泌的抑制程度仍显著低于健康对照者，这说明经过HD-DXM治疗，患者的血小板计数升高到相对安全的范围，但其CD5+B细胞对CD4+T细胞的免疫调节功能尚未完全恢复，患者仍处于免疫失衡状态，这可能是导致疾病复发的原因之一。本研究中有2例患者同时使用具有免疫调节功能的丙种球蛋白，其对T细胞分泌IFN-γ的影响尚无明确定论，丙种球蛋白联合地塞米松对T细胞分泌细胞因子方式的影响及其临床意义值得进一步探讨。

本研究还比较了CD5-B细胞与CD5+B细胞在免疫调节功能上的差异。无论是在健康对照者还是ITP患者中，共培养72 h，CD5-B细胞均不能抑制CD4+T细胞分泌IFN-γ，在ITP患者中随着CD5-B细胞比例的增加，反而有促进CD4+T细胞分泌IFN-γ的趋势。共培养时间延长至144 h，健康对照组中随着CD5-B细胞比例的增加，表现出对IFN-γ的分泌有一定的抑制作用，而ITP患者中CD5-B细胞对IFN-γ的分泌几乎不产生影响。Lemoine等［19］研究认为，在T细胞与B细胞相互作用的过程中，B细胞可上调CD5的表达并获得抑制T细胞免疫反应的能力。ITP患者中B细胞的异常表现提示其获得免疫抑制功能的通路受阻，但具体机制有待深入研究。

总之，本研究发现原发性ITP患者CD5+B细胞抑制CD4+T细胞分泌Th1型代表性细胞因子IFNγ的能力明显受损，但是对Th2型代表性细胞因子IL-4的分泌无明显影响。HD-DXM治疗有效的ITP患者中，CD5+B细胞抑制IFN-γ 分 泌的能力可部分恢复。本研究一方面揭示了CD5+B细胞在ITP疾病发生发展尤其是Th1/Th2失衡中可能发挥的作用，另一方面也为ITP患者B细胞免疫调节功能缺陷制定相应的治疗策略提供了实验基础。