陈佳丽 张茂表 陆嘉辉 贾改丽 李 军 曹 红

（温州医科大学附属第二医院麻醉科；温州医科大学疼痛医学研究所，温州 325027）

糖尿病是一种常见的慢性疾病，全球有超过4.25亿成人患病，约90%的糖尿病病人是2型糖尿病[1]，而糖尿病神经病理性疼痛(diabetic neuropathic pain, DNP)是糖尿病最常见的慢性并发症之一，大约1/3以上的糖尿病人会并发DNP，严重影响病人的正常生活，且现有药物治疗效果不佳[2]。临床上主要表现为自发痛、感觉异常、痛觉过敏以及异常性疼痛[3]，然而其病理生理机制尚未阐明。近年研究表明，长期高血糖导致的神经受损异常放电、交感神经激活和氧化应激性代谢紊乱是DNP的主要发病机制[4]。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是一系列具有高度活性的氧自由基的总称，研究发现，包括神经病理性疼痛和炎性疼痛在内的持续性疼痛与ROS的过度表达有关[5]。自噬是一种溶酶体依赖性的自我消化过程，回收利用损伤或功能不足的蛋白质或细胞器，比如受损的线粒体[6]。在神经病理性疼痛模型中，脊髓神经元和胶质细胞中自噬活动都有明显改变，自噬在慢性疼痛中起到重要作用[7]。而研究表明ROS作为信号分子参与自噬的调节[8]，但ROS与自噬在2型糖尿病神经病理性疼痛中的作用尚未见报道，本实验我们拟观察ROS对脊髓自噬的影响，探讨脊髓ROS介导自噬与大鼠2型DNP的关系。本研究将首次阐明DNP中两种重要致病因素ROS与自噬之间的关系，为临床上治疗DNP提供可行的新思路。

方 法

1.主要试剂及仪器

链脲佐菌素 (streptozocin, STZ)，N-叔丁基-α-苯基硝酮(N-tert-Butyl-α-phenylnitrone, PBN)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)均购自Sigma；ROS检测盒购自南京建成生物公司；Beclin 1抗体、LC3和p62抗体均购自Abcam；β-actin抗体购自北京中杉金桥公司；2390型Electronic von Frey触觉测痛仪及II Tc336型甩尾足底测试仪购自IITC；电泳转膜仪购自Bio-Rad；荧光显微镜购自Leica。

2.动物模型制备及分组

清洁级雄性SD大鼠，120～150 g，由温州医科大学实验动物中心提供。大鼠饲养于12 h/12 h昼夜交替，温度23℃～25℃，自由摄食摄水的环境中。适应环境3 d后，将其随机分为两组：正常对照组（C组，n= 10）和高脂高糖喂养组（DA组，n= 80），正常对照组始终给予正常饲料喂养，高脂高糖组喂养高脂高糖饲料（67%普通饲料+ 10%猪油+ 20%蔗糖+ 2%胆固醇+ 1%胆酸钠）喂养8周诱导胰岛素抵抗，于第0周、第8周分别测体重、血糖，并在第8周时取大鼠尾静脉血用ELISA法测血清胰岛素水平，计算胰岛素敏感性（ISI, 1÷空腹血糖×血清胰岛素）。测量第8周时大鼠的机械缩足反应阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)，设为基础值。高脂高糖喂养8周后，大鼠诱导出胰岛素抵抗，禁食不禁饮12 h，腹腔单次注射STZ (35 mg/kg)。3 d后测量大鼠尾静脉血糖，血糖稳定且≥16.7 mmol/L为2型糖尿病制备成功，14 d后测量大鼠痛阈值，MWT和TWL均下降至基础值的85%以下为2型糖尿病神经病理性疼痛组，而MWT和TWL均高于85%基础值的归为2型糖尿病不痛组（PL组）。采用随机数字表法，将2型DNP大鼠分为3组：DNP组，DNP + PBN组（DNP +ROS清除剂组），SC组（溶剂对照组），每组10只。PBN的给药方式为腹腔注射，100 mg/kg，溶解于DMSO，在STZ注射14 d，模型制备成功后，每天1次，连续给药14 d，DNP组不做任何处理，SC组给予同体积的DMSO。

3.方法

（1）ELISA—胰岛素和胰岛素敏感指数测量：在喂养8周后，禁食不禁饮12 h后，取正常对照组和高脂高糖组大鼠尾静脉血，用ELISA测试盒检测大鼠胰岛素浓度，并通过计算公式（1÷空腹血糖×血清胰岛素）计算得出胰岛素敏感指数，此计算所得数值为非正态分布，故采用其自然对数进行统计分析。

（2）行为学测定：喂养8周后测量大鼠的机械缩足反应阈值和热缩足反应，设为其基础值，在STZ注射14 d后和给药3、7、14 d后分别测量大鼠的机械缩足反应阈值和热缩足反应。

机械缩足反应阈值的测定：将大鼠置于金属丝网底笼(22 cm×22 cm×22 cm)中并适应30 min，玻璃箱被置于高于实验台面50 cm。用IITC 2390型Electronic von Frey触觉测痛仪垂直刺激后爪的足底表面，单次刺激时间≤1 s，刺激间隔10 s。记录大鼠抬起其后爪的刺激强度，测量5次，每次间隔5 min，并将平均值用作MWT。

热缩足潜伏期的测定：将大鼠置于透明的方形有机玻璃盒（3 mm厚，20 cm×15 cm×30 cm）中并适应30 min。将后爪的中心暴露于由IITC 336型足底/甩尾测试仪设定的热刺激。动物的反应时间从辐射热测量开始直到大鼠缩足或舔足并记录为TWL，双足各测定5次，每次间隔5 min，并将平均值用作TWL。

（3）标本取材和处理：给药后第3 d、7 d、14 d取各组大鼠L4-L6脊髓腰膨大，并放入超低温冰箱中备用于Western blot实验。另取5只大鼠麻醉后经心脏灌注先生理盐水后4%多聚甲醛，取L4-L6脊髓腰膨大，固定脱水后用OCT包埋，切片，用作免疫荧光实验。

（4）Western blot：将组织标本按重量体积比1:10加入裂解液，充分研磨，超声离心后取上清液，后用BCA法测定蛋白浓度。按照30 μg、10 μl每孔上样，经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到0.45 μm PVDF膜上，10%脱脂牛奶常温摇床2 h，以封闭非特异性蛋白位点，再分别加入Beclin 1抗 体 (1:2 000)、LC3抗体 (1:1 000)、p62抗体(1:20 000)和β-actin抗体(1:3 000)中，4℃孵育过夜，次日取出条带用TBST洗膜3次，每次10 min，加入碱性磷酸酶标记的IgG抗体，室温下孵育2 h后用TBST洗膜3次，每次10 min，ECL曝光。条带采用Quantity One进行分析，以目的蛋白/β-actin的灰度值作为目的蛋白表达的相对强度。

（5）免疫荧光染色使用冰冻切片机将已灌注包埋好的组织切成6 μm厚的切片，室温下复温30 min，PBS洗片3次，每次10 min，随后在室温下用含0.2%Triton X-100的PBS溶液渗透30 min，用免疫荧光封闭液（碧云天）37℃下封闭15 min，再分别加入Beclin 1抗体(1:200)、NeuN抗体(1:200)、IBA抗体(1:200)、GFAP抗体(1:200)，4℃过夜，次日用PBS洗片（如前），加入荧光标记二抗，37℃孵育1 h后PBS洗片（同前），DAPI染核，封片，荧光显微镜观看组织形态。

（6）ROS含量检测：根据ROS检测试剂盒说明操作，测量脊髓腰膨大中的ROS含量。荧光探针2，7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)用于检测ROS，其自身非荧光，在ROS的存在下被氧化成发荧光的DCF。取100 mg脊髓腰膨大组织，用机械法制备成单细胞悬液，用PBS洗涤2次，加入10 μM DCFH-DA 37℃孵育30 min，用PBS洗涤后，使用流式细胞仪检测ROS含量，通过CytExpert分析软件统计处理。

4.统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差(D)表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD法），P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.各组大鼠体重、血糖、胰岛素敏感指数的变化情况

与正常对照组（C组）比较，高脂高糖组（DA组）大鼠的体重在第8周时明显升高(P< 0.05)，注射STZ 14 d后体重下降明显(P< 0.05)，而空腹血糖在第8周时无明显变化，注射STZ 3 d后血糖明显升高（P< 0.05，见表1）。第8周时，高脂高糖组（DA组）大鼠的胰岛素水平较正常对照组（C组）明显升高(P< 0.05)，胰岛素敏感指数下降(P< 0.05)，产生胰岛素抵抗（见表2）。

2.各组大鼠MWT和TWL的变化

与C组比较，PL组大鼠MWT和TWL均无明显改变，两组差异无统计学意义；而DNP组和SC组与C组比较，MWT明显降低(P< 0.05)，TWL缩短(P< 0.05)；当腹腔内注射ROS清除剂PBN后，与DNP组比较，DNP + PBN组在给药后第3 d、7 d、14 d MWT升高(P< 0.05)，TWL明显延长(P< 0.05)。DNP组和SC组两组之间MWT和TWL差异无统计学意义（见图1）。在注射STZ 17 d、21 d、28 d后DNP组中ROS含量明显升高(P< 0.05)，说明2型糖尿病神经病理性疼痛大鼠的ROS相关氧化应激活性增强 （见图2）。

表1 C组和DA组体重、血糖的比较 (n = 10,D)Table 1 Comparison of weight and blood glucose between group C and group DA (n = 10,D)

表1 C组和DA组体重、血糖的比较 (n = 10,D)Table 1 Comparison of weight and blood glucose between group C and group DA (n = 10,D)

*P < 0.05，与C组比较，compared with group C.

体重Weight (g) 血糖Blood glucose (mmol/L)0 week 8 weeks 14 d after STZ 0 week 8 weeks 3 d after STZ C 138±7 365±10 434±18 3.5±0.4 3.6±0.5 4.4±0.7 DA 134±11 427±23* 320±26* 3.7±0.9 4.0±0.7 29.3±3.8*组别Group

表2 C组和DA组胰岛素水平、胰岛素敏感指数的比较 (n = 10,D)Table 2 Comparison of insulin levels and insulin sensitivity index (ISI) between group C and group DA (n = 10,D)

表2 C组和DA组胰岛素水平、胰岛素敏感指数的比较 (n = 10,D)Table 2 Comparison of insulin levels and insulin sensitivity index (ISI) between group C and group DA (n = 10,D)

*P < 0.05，与C组比较，compared with group C.

胰岛素水平Insulin levels (mU/L) 胰岛素敏感指数ISI 0 week 8 weeks 0 week 8 weeks C 16.5±1.4 16.9±2.3 -4.13±0.29 -4.38±0.21 DA 16.8±0.8 46.1±5.0* -4.19±0.18 -7.21±0.22*组别Group

图1 各组大鼠MWT和TWL的变化 (n = 10,D)Fig.1 Changes of MWT and TWL in each group of rats (n = 10,D)

3.DNP中发生的自噬可被PBN抑制

DNP大鼠给予PBN后第3 d、7 d、14 d，Western blot检测脊髓腰膨大中的蛋白表达量，与C组比较，PL组的脊髓中Beclin 1和p62表达无明显改变，而LC3-II表达上调(P< 0.05)，说明自噬体合成增加；与PL组比较，DNP组和SC组的脊髓中LC3-II和Beclin 1表达均明显上调(P< 0.05)，而p62表达量明显下降(P< 0.05)，说明DNP组大鼠脊髓自噬功能激活；与DNP组比较，使用了ROS清除剂PBN后，脊髓中的LC3-II和Beclin 1表达均明显下降(P< 0.05)，而p62表达量升高(P< 0.05)；DNP组和SC组间差异无统计学意义（见图3）。免疫荧光染色显示在脊髓背角中自噬的标记蛋白Beclin 1主要与小胶质细胞的标记蛋白(IBA)和星形胶质细胞的标记蛋白(GFAP)共定位，表明自噬可能主要发生在脊髓背角的小胶质细胞和星形胶质细胞中（见图4）。

图2 流式细胞仪检测大鼠脊髓中ROS的含量 (n = 4,D)Fig.2 The production of ROS in spinal cord detected by flow cytometry (n = 4,D)

讨 论

活性氧(ROS)作为一部分正常细胞代谢所产生的具有活性的含氧化合物，主要包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等。中枢神经系统中ROS的主要来源是线粒体内膜中的电子传递链，在生理状态下的低浓度ROS对于机体防御功能是必要的，但过量的ROS会导致脂质过氧化、蛋白质氧化、核酸氧化[9]。既往研究表明，ROS参与多种疾病的病理生理过程，包括哮喘、动脉粥样硬化、阿尔兹海默病等，近期研究显示ROS在各种疼痛疾病模型中起着关键性作用，包括炎性疼痛和神经病理性疼痛。使用ROS清除剂如PBN[10]、维生素E[11]、Tempol[12]等，可以有效缓解神经病理性疼痛模型大鼠的疼痛行为。本研究结果表明，与正常大鼠或糖尿病无痛大鼠比较，在造模成功后第3 d、7 d、14 d 糖尿病神经病理性疼痛大鼠脊髓中ROS含量明显增加，使用ROS清除剂PBN后，糖尿病神经病理性疼痛大鼠的疼痛行为显著缓解，提示脊髓中ROS含量增加参与了2型糖尿病神经病理性疼痛发生维持的机制。

自噬是真核细胞通过溶酶体系统降解自身成分的一种高度保守的分解代谢途径，在多种应激状态下，对于清除氧化或受损的细胞器或蛋白质以及维持新陈代谢和分子合成具有非常重要的作用[13]。文献报道自噬激动剂雷帕霉素可以产生长时程的镇痛和抗炎效果，且激活自噬可以促进神经再生和髓鞘形成，防止慢性疼痛的形成，而自噬阻滞剂3-MA会使神经病理性疼痛得到明显的加重和延长[7]。研究证明，活性氧的产生、低氧刺激、病毒感染等可刺激自噬的发生，而ROS可以通过Atg4、过氧化物酶、线粒体电子传递链(mETC)等不同机制来诱发自噬[8,14,15]。

LC3（微管相关蛋白-3）是经典的自噬指标，以LC3 I和LC3 II两种形式存在，其中LC3 I是非活化形式，主要存在于胞质中；LC3 II一直定位于自噬体膜上直至被溶酶体酶降解，因此是目前反映细胞内自噬水平的特异性标记蛋白[16]。Beclin 1是自噬相关蛋白之一，在自噬泡起始合成步骤中起关键作用，并且是BECN1/VPS34/VPS15复合物（也称为PI3KC III）的组分[17]。由于自噬是一个动态变化的过程，因此自噬小体的增加并不能说明自噬的水平，还需要检测自噬降解水平的标记物p62。根据文献报道，自噬降解水平增加，p62减少[18]。观察各组大鼠自噬标记物的表达量变化，本实验研究发现DNP组大鼠Beclin 1、LC3 II/LC3 I蛋白含量增加，p62表达量减少，说明自噬功能增强，而使用ROS清除剂后，自噬功能减弱，行为学分析上DNP组在使用PBN后MWT明显升高，TWL延长。这说明过多的ROS可以通过激活自噬来清除氧化的蛋白和损伤的细胞器从而利于细胞存活。由此我们可以得出一个结论，即在2型糖尿病神经病理性疼痛中，ROS过多是导致DNP发生的原因，而过多的ROS会激活自噬，自噬是一种保护机制。本文首次阐明了2型DNP中ROS与自噬之间的关系，然而自噬在本模型中具体的调控机制尚未阐明，有待进一步研究。

图3 Western blot法检测大鼠脊髓中LC3-I, LC3-II, Beclin 1和p62的表达 (n = 4,D)Fig.3 The expression of LC3-I, LC3-II, Beclin 1 and p62 in spinal cord by Western blot (n = 4D)

综上所述，在2型糖尿病神经病理性疼痛中脊髓ROS增多后激活自噬，这有助于发现新的治疗靶点。

图4 免疫荧光染色显示Beclin 1主要定位于脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞上 Scale bar = 50 μmFig.4 Immunofluorescence staining showed that the major Beclin 1 (red) co-localizes with microglia (IBA, green) and astrocyte(GFAP, green).Scale bar = 50 μm