李晓鹤，王江华，季 颖，刘 艳，朱 凌，贾玉缘，王震宇，史羿君，张海莹，饶慧瑛

北京大学人民医院 北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京 100044

戊型肝炎是一种世界范围流行的严重威胁人类健康的肠道传染病[1-2]。全球每年新发戊型肝炎约330万例，其中死亡约4.4万人，并可导致约5200例孕妇流产。我国是戊型肝炎的高流行区之一，曾多次爆发戊型肝炎，人群发病率呈上升趋势[3]。戊型肝炎虽为急性自限性疾病，但其病死率高于甲型肝炎和乙型肝炎，在我国成年人急性病毒性肝炎中占首位[4]。粪-口途径传播是其主要传播方式，亦见于输血和垂直传播，主要表现为急性肝功能损害，易发展为肝衰竭，病死率很高[5]。戊型肝炎包括4个主要的基因型，我国流行的病毒株主要是基因4型[6-7]。近年来，上海、浙江等地的猪群中也陆续发现HEV 3感染[8]。目前戊型肝炎的实验室诊断主要包括HEV核酸(HEV RNA)检测、HEV IgM抗体和HEV IgG抗体检测[7]。研究[9-11]报导了不同HEV IgM抗体检测试剂灵敏度不一致，而且特异度差，并且疱疹病毒感染会导致HEV IgM抗体检测结果假阳性[12]；目前，关于HEV RNA和HEV抗原(HEV Ag)在临床诊断HEV感染中作用的研究很少，因此，本研究将分析HEV抗体阳性标本中HEV RNA、HEV Ag的阳性率及基因型检出情况，同时对生化指标进行分析，并进一步研究抗体对HEV Ag检测影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2015年5月-2019年4月在北京大学人民医院进行HEV IgM抗体和HEV IgG抗体检测的标本共13 992例。排除合并HBV感染、HCV感染的患者。所有血清标本分装后-80 ℃冷冻备用。本研究方案通过北京大学人民医院伦理委员会批准(批号：RDY2016-13)。

1.2 HEV IgM抗体、HEV IgG抗体、HEV Ag检测 北京万泰生物药业股份有限公司HEV IgM抗体(批号：EM20190502A)、HEV IgG抗体(批号：EG20190502A)、HEV Ag(批号：EV20181204)检测试剂盒(酶联免疫法)，检测波长450 nm。阳性对照吸光度(OD)值平均值≥0.80，阴性对照OD值平均值≤0.10，依据临界值(S/CO值)对检测结果进行判定，若样本的OD值<临界值，则判断HEV IgM抗体、HEV IgG抗体、HEV Ag阴性，若检测样本的OD值≥临界值，则判断HEV IgM抗体、HEV IgG抗体、HEV Ag阳性。HEV IgM抗体(万泰)样本临界值=0.26+3次阴性质控平均值，HEV IgG 抗体(万泰)样本临界值=0.16+3次阴性质控平均值,HEV Ag(万泰) 样本临界值=0.12+3次阴性质控平均值。

1.3 HEV RNA检测 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂提取HEV RNA，每次需140 μl血清，50 μl洗脱液进行洗脱。HEV RNA扩增检测使用北京金豪制药生物有限公司试剂盒(批号：20190603002)，反应条件：50 ℃ 30 min，95 ℃ 3 min; 95 ℃ 15 s, 50 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min,5 cycles；95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，40 cycles;检测灵敏度1.0×103拷贝/ml，HEV PCR反应液 20 μl，HEV Taq酶0.6 μl，HEV 逆转录酶0.2 μl，配套仪器为瑞士罗氏公司的Light Cycler荧光定量PCR仪。

1.4 HEV 序列分析 HEV上游引物序列为5′-CGGTGGTTTCTGGGGTGA-3′，HEV下游引物序列为5′-GCGAAGGGGTTGGTTGGA-3′，巢式PCR进行扩增，PCR产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行序列分析。

1.5 实验室指标 AST、ALT、TBil、DBil水平采用全自动生化分析仪检测，参考范围分别为9～50 U/L、15～40 U/L、3～21 μmol/L、0～7 μmol/L。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用中位数(最小值～最大值)表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 13 992例标本中HEV IgM抗体或HEV IgG抗体检测阳性的血清标本共1924例(单纯HEV IgM抗体阳性标本27例、单纯HEV IgG抗体阳性标本1772例、HEV IgM抗体和HEV IgG抗体同时阳性标本125例)，其中HEV IgM抗体阳性152例(7.9%)，HEV IgG抗体阳性1897例(98.6%)。1924例中男1123例，女801例，年龄45(11～88)岁，ALT 156.4(12.0～4501.0)U/L，AST 187.5(16.0～2587.0) U/L，TBil 32.5(3.8～484.0) mol/L，DBil 22.8(0.8～318.0) mol/L。HEV IgM抗体且HEV IgG抗体检测阴性的血清标本共12 068例(丙型肝炎13例、乙型肝炎69例、血液系统疾病4896例、自身免疫病34例、其他未明确诊断如转氨酶升高等7056例，且HEV RNA均阴性)。

2.2 HEV RNA阳性率 1924例HEV IgM抗体或HEV IgG抗体阳性患者中HEV RNA阳性62例(3.2%)。152例HEV IgM抗体阳性患者的HEV RNA阳性率为40.8%(62/152)；1897例HEV IgG抗体阳性患者的HEV RNA阳性率为3.0%(57/1897)(表1)。

表1 HEV RNA在HEV IgM抗体和HEV IgG抗体中的检出情况

2.3 HEV Ag阳性率 1924例HEV IgM抗体或HEV IgG抗体阳性患者中HEV Ag阳性55例(2.9%)。HEV RNA阳性组中HEV Ag阳性率为88.7%(55/62)；HEV IgM抗体阳性组中，HEV Ag阳性率为36.2%(55/152)；HEV IgG抗体阳性组中HEV Ag阳性率为2.6%(50/1897)(表2)。

表2 HEV Ag在HEV RNA和HEV IgM抗体中的检出情况

2.4 肝功能指标与HEV RNA、HEV Ag的关系 将152例HEV IgM抗体阳性患者分为HEV RNA阳性组和HEV RNA阴性组，阳性组ALT、AST、TBil、DBil水平明显高于阴性组(P值均<0.001)。152例HEV IgM抗体阳性患者分为HEV Ag阳性组和HEV Ag 阴性组，阳性组ALT、AST、TBil、DBil水平明显高于阴性组(P值均<0.001)(表3)。

2.5 HEV序列分析 荧光定量PCR结果显示，HEV RNA阳性62例标本；巢式PCR扩增测序检测结果显示，HEV RNA阳性58例标本，4例阴性(HEV RNA病毒载量低，PCR扩增条带弱)(图1)。58例经测序发现HEV 基因型均为4型，未见报道中提到的3型和1型。

图11～9号HEVRNA阳性样本PCR电泳图

2.6 HEV IgG抗体对HEV Ag检测结果的影响 为了检测HEV IgG抗体对HEV Ag测定的影响，5例HEV基因4型的HEV IgG抗体阴性且HEV Ag阳性的血清样本中4例(另1例由于血清不足，未行下一步研究)用HEV RNA、HEV IgM抗体和HEV IgG抗体均阴性血浆连续2倍稀释(稀释倍数分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32)，将4个系列稀释样本分别加入到HEV Ag阴性且HEV IgG抗体阴性的血清和HEV Ag阴性且HEV IgG抗体阳性血清中。HEV Ag试剂盒检测结果显示，与混合有HEV Ag阴性且HEV IgG抗体阴性血清的样品相比，混合有HEV Ag阴性且HEV IgG抗体阳性血清样本的HEV Ag S/CO值明显降低，甚至出现阴性结果(图2，表4)。

图2 HEV IgG抗体对HEV Ag检测结果的影响

表3 肝功能指标和戊型肝炎标志物的关系

表4 4例系列稀释样本的HEV Ag S/CO值

注：HEV IgM抗体样本临界值为0.269; HEV IgG抗体样本临界值为0.178; HEV Ag样本临界值为0.134。

3 讨论

戊型肝炎的诊断主要依赖于实验室检测，在我国临床中，急性戊型肝炎诊断率与实际感染率存在严重不符的现象，主要由于戊型肝炎实验室诊断技术的落后。在戊型肝炎潜伏期及疾病早中期，患者粪便和血清中常可检出HEV RNA，早于临床症状出现，是急性戊型肝炎确诊的金标准。发病后HEV RNA在血液中持续检测至6～7周，但传统的HEV IgM抗体试剂的特异度较差，急性病毒感染、类风湿因子等标本容易造成检测假阳性[12]。因此，现有的HEV IgM抗体诊断试剂还不能满足临床需求。而HEV IgG抗体这一指标的缺陷依然十分突出，许多患者康复后HEV IgG抗体可以持续超过10年，并且在健康人群中也可检出，无法区分急性感染和既往感染。这些缺陷造成临床上误诊和漏诊十分常见。荧光定量PCR 检测技术，具有较高的灵敏度和特异度，重复性好，准确度高，可以在疾病的窗口期检出HEV。目前，由于HEV RNA检测方法复杂，对人员要求高等方法学的限制，北京地区开展HEV RNA检测的医院非常少。

本研究发现，HEV IgM抗体阳性组中HEV RNA阳性率为40.8%(62/152)，HEV Ag阳性率为36.2%(55/152)，HEV RNA阳性组中HEV Ag阳性率为88.7%(55/62)，HEV Ag与HEV RNA检出的一致性很好。HEV RNA阴性组中HEV IgM抗体阳性的患者90例，同时这部分患者的转氨酶水平均值为141.6 U/L，表明这部分患者HEV IgM抗体可能是假阳性结果，因此开展戊型肝炎的核酸和抗原检测尤为重要。本研究发现62例HEV RNA阳性的患者，58例经测序发现HEV 基因型均为4型，未见报道中提到的3型和1型，与Wang等[13]报道相近，在我国猪群中发现基因3型感染，但至今我国仍未有人类感染基因3型的报道[8]。1924例患者中1840例HEV RNA阴性/HEV IgG抗体阳性的患者，表明存在HEV的既往感染，进一步说明HEV IgG抗体无法区分既往感染和急性感染。另外，本研究发现在HEV RNA阳性的人群中AST、ALT、TBil、DBil水平都明显高于HEV RNA阴性人群，因此如果HEV IgM抗体阳性，并同时伴转氨酶高水平、胆红素水平升高，具有一定辅助诊断戊型肝炎的作用,另有研究[14]报道62例HEV IgM抗体阳性组AST、ALT、DBil和TBil水平升高，但由于HEV RNA只有16例，没有比较HEV RNA阳性组和阴性组生化指标的区别。本研究发现HEV IgG抗体阳性高水平会降低HEV Ag检测的S/CO值，甚至转变成阴性结果，因此，当HEV IgG抗体高水平阳性时，如果HEV Ag检测的S/CO值阴性，要注意是否HEV IgG抗体抑制了HEV Ag检出。

综上所述，HEV Ag是HEV诊断的新标志物，对戊型肝炎的临床诊断具有一定的价值，而HEV IgM抗体阳性、转氨酶或胆红素高水平对戊型肝炎具有辅助诊断的作用。