孙承文，赖迎迢，巩华，刘春花，曹少卫，梁慧丽，陶家发

(中国水产科学研究院 珠江水产研究所，广东 广州 510380)

水产养殖中，水体的不稳定性是病害暴发的原因之一。水产养殖中，病害的发生与区域水土、气候、养殖习惯等密切相关。在养殖区域水体中，加入微型生物养护剂，可优化区域养殖水体中微生物、原生动物、藻类等微型生物多样性，维护养殖水体环境动态稳定性，促进养殖系统各层次关系的持续平衡，使得病原在养殖系统多样性机制中共存而不致病，减少病害暴发的不利因素。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

芽孢菌富集培养基：蛋白胨5.00 g，葡萄糖10.00 g，酵母膏3.00 g，硫酸镁0.50 g，磷酸氢二钾0.50 g，氯化钠0.20 g，加入1 L超纯水混合均匀后调节pH至7.0～7.2，121 ℃灭菌15 min。

好氧反硝化菌富集培养基：磷酸二氢钾1.50 g，硫酸镁0.01 g，磷酸氢二钠7.90 g，微量元素溶液2 mL，枸橼酸钠5.66 g，硝酸钠0.84 g，加入1 L超纯水混合均匀后调节pH至7.0～7.5，121 ℃灭菌15 min。

微量元素溶液：EDTA-2Na 50.00 g，ZnSO4·7H2O 3.93 g，CaC12·2H2O 7.28 g，MnC12·4H2O 5.06 g，FeSO4·7H2O 5.00 g，(NH4)6Mo7O2·4H2O 1.10 g，CuSO4·5H2O 2.45 g，CoC12·6H2O 1.61 g，加入1 L超纯水混合均匀后调节pH至7.0。

1.1.2 固体发酵原料

豆粕、麸皮、米糠等购自当地饲料厂。

1.2 方法

1.2.1 菌群富集培养

采集各地养殖区域内丰产且少病害发生的养殖池塘水和底泥，进行芽孢杆菌和好氧反硝化菌群的富集培养。芽孢杆菌富集培养：取1 mL池塘水样加入含9 mL富集培养基的试管中，28 ℃摇床培养24 h后，80 ℃水浴15～20 min，取100 μL样品，在平板涂布，28 ℃培养24 h。好氧反硝化菌富集培养：取10 mL池塘水接种到装有100 mL灭菌的富集培养基中，28 ℃、120 r·min-1培养2～3 d后备用。

1.2.2 池塘微型生物养护剂制备

富集培养菌液(菌液浓度大于1×109CFU·mL-1)混合池塘泥水，按照料水比1∶(0.6～1)加入到固体培养料(麸皮∶米糠∶豆粕5∶4∶1)中，混匀后堆放并用薄膜覆盖。采用自然固体发酵方法进行发酵，观察料温变化，每天上午、下午各翻堆1次，使得料温不超过50 ℃，固体发酵培养2～3 d，待培养料颜色变深、有发酵物的香味时，用薄膜袋分装、密封，室温放置几天后备用。分别于不同发酵时间采集样品，制备微型生物养护剂A、B，其中芽孢杆菌和反硝化菌含量均为106CFU·g-1。

1.2.3 池塘微型生物养护剂降氨作用的测定

试验分为4组，每组3组平行，各5尾小规格罗非鱼(体长2 cm)，饲养在氨氮含量为2.5 mg·L-1水中，水体中含有藻类、浮游动物、细菌等微型生物，每日投喂饲料，投喂量以食用完为准。处理1添加池塘微型生物养护剂A(添加量为0.02 g·L-1)，处理2添加池塘微型生物养护剂B(添加量为0.02 g·L-1)，处理3添加芽孢杆菌和好氧反硝化菌混合液(含芽孢杆菌、反硝化菌，各菌群浓度为>109CFU·mL-1)，处理4为空白对照。每日11:00采集各小组水样，以比色法测定氨氮含量。

1.2.4 池塘微型生物养护剂的应用效果

在海南、广东、河南、江苏等地养殖池塘分别添加微型生物养护剂，根据当地养殖池塘情况，在晴天上午使用，每hm2使用剂量为15～30 kg，取5～10倍池塘水混合搅拌均匀后全池泼洒，2～5 d使用1次，并根据水体、气温等调节用量与间隔。使用护料后检测养殖水体的水质情况。

2 结果与分析

2.1 微型生物养护剂品质检测

采集特定养殖区域的丰产养殖池塘水、底泥，进行芽孢杆菌和好氧反硝化菌群的富集培养，经检测，富集培养液中芽孢杆菌活菌数大于3.0×109CFU·mL-1，好氧反硝化菌群活菌数大于2.1×109CFU·mL-1。

在固体发酵培养时，经过48～72 h的固体发酵培养，培养物为棕黄色混合料，带酸香味，经活菌检测，芽孢杆菌和好氧反硝化菌群活菌数均大于1×106CFU·mL-1。

2.2 池塘微型生物养护剂的降氨作用

如表1所示，经连续4 d水体降氨氮模拟试验观察，与对照组相比，添加池塘微型生物养护剂A、B和添加芽孢杆菌和好氧反硝化菌混合液组水体中氨氮含量均下降到0.1 mg·L-1。试验结果表明，添加微型生物养护剂对养殖水体中的氨氮具有良好的降低作用。

表1 不同处理对水体中氨氮浓度的影响

2.3 池塘微型生物养护剂的应用效果

在海南、广东、河南、江苏等地利用当地饲料原料，按照1.2.2制备池塘微型生物养护剂，使用效果如下。一是微型生物养护剂具有优化养殖池塘的微型生物多样性的作用。海南文昌市昌洒镇饲养罗非鱼的池塘使用微型生物养护剂后，水体中藻类结构由贫营养型(2×104个·L-1)转变为绿藻等有益藻类群落为主的中营养型(4×106个·L-1)；广东中山民众镇饲养草鱼的池塘使用微型生物养护剂后，水体中优势藻类由裸藻门变为绿藻门，藻类密度增加，由使用前的3.17×105个·L-1增加为7.33×105个·L-1。二是微型生物养护剂具有维持养殖过程中水质稳定的作用。河南洛阳饲养鲤鱼的池塘使用微型生物养护剂后，水体中氨氮含量由2.50 mg·L-1逐渐降低至0.02 mg·L-1，并保持较低水平。三是微型生物养护剂可降低鱼死亡率。江苏盐城饲养草鱼和鲫鱼的池塘使用微型生物养护剂后，鱼死亡量较对照组显著下降(表2)。

表2 添加微型生物养护剂对鱼群死亡量的影响

3 讨论

水产养殖业常出现具有区域特征的大规模流行病，养殖水体环境恶化是发病的主要原因之一。为改善池塘养殖水体，维持良好的养殖水体环境，减少病害发生，降低抗生素等药物使用，已有研究采用芽孢杆菌、硝化细菌、光合细菌、酵母菌、乳酸菌等有益微生物制剂改良养殖水体水质，取得了较好的效果[1-6]。同时，有研究采用生物絮团技术，通过调节池塘碳氮比，将池塘中积累的氮转化为菌体蛋白，改善池塘水质，降低饵料系数[7-10]。芽孢杆菌、硝化及反硝化细菌具有较好的改善水质、降低氨氮含量的作用[11-16]，与此同时，在水体中加入外来微生物可能导致区域水体环境恶化。已有学者采用土著微生物来改善池塘养殖水体，并取得了较好的效果[17]。

本研究利用区域内高产、病害少的池塘优质养殖水体，富集培养得到芽孢杆菌和好氧反硝化菌等

土著菌群，添加到固体培养料，通过固体发酵培养，进一步扩大土著微生物量，制备微型生物养护剂并应用于该区域的池塘养殖中。本研究对如何维护养殖水体环境平衡进行了初步探索，但具体的作用机制等还需要进一步研究。