江 鸿，费安兴，魏莉平，邹甜甜，何 松，李 胜

(鄂东医疗集团黄石市妇幼保健院检验科，湖北黄石 435000)

国际糖尿病协会权威数据显示，糖尿病的发病呈快速增长和低龄化的态势，已跃居全世界发病率和病死率最高的疾病之一。全球糖尿病患者在2010年已接近3亿，预计到2030年将超过4.35亿，糖尿病及并发证已成为全球范围内日益严重的健康问题。糖尿病将成为世界经济增长的主要牵制力之一，这显示了全球糖尿病防治的严峻形势。

妊娠期糖尿病(GDM)是指在妊娠期间首次发生或发现的葡萄糖耐量异常，是糖尿病的一种特殊类型，其发病率在各国差异较大，为1%～14%。GDM对孕妇、胎儿和新生儿均有较大的负面影响，GDM患者中羊水过多、妊娠期高血压、巨大儿、剖宫产、胎儿畸形、新生儿低血糖、低血钙、新生儿窒息甚至死亡的发生率明显增高，GDM产妇自己发展为2型糖尿病的概率也会大大增加，且其分娩的子女(特别是出生时为巨大儿的子女)成年后发生肥胖及2型糖尿病等代谢性疾病的概率也会显著增高，这种遗传效应导致糖尿病的发病具有明显的家族聚集性，这对患者的整个家庭乃至整个社会都会造成极大的影响[1-3]。本研究以黄石地区孕妇人群为研究对象，通过高通量技术平台，检测GDM孕妇外周血胎儿游离DNA，筛选孕妇妊娠期胎儿染色体非整倍数拷贝变异，为进一步解析影响妊娠期孕妇糖尿病致病基因的分子机制研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2019年1-6月来鄂东医疗集团黄石市妇幼保健院围保门诊产检的GDM孕妇的静脉血样本作为GDM组，共15例；健康对照组为体检健康孕妇，共15例。孕妇年龄22～35岁，孕周12～26周。GDM的诊断标准参照《妇产科学》第6版[4]和国家原卫生部妊娠期糖尿病的筛查和诊断标准(2011年)[5]。GDM组孕妇与健康对照组均为单胎，年龄、孕周差异无统计学意义(P>0.05)，所有健康对照组孕妇体检健康，无高血压、糖尿病史等其他既往病史。本研究经鄂东医疗集团黄石妇幼保健院伦理委员会批准(1.0版，2018-12-24)。

1.2方法

1.2.1血浆DNA抽提 GDM组是血糖耐受量异常组，健康对照组是正常血糖浓度组。通过采集孕妇外周静脉血10 mL左右，乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，1 500 g离心10 min，取分离得到的母体血浆进行胎儿游离DNA提取，参照华大基因核酸提取试剂盒进行操作。首先，配置蛋白酶K溶液，在96孔内按照1∶10比例加入蛋白酶K和磁珠液，用封口胶密封，50 ℃恒温振荡器中250 r/mim洗脱1 h。然后，在每孔内加入20 μL磁珠和400 μL binding buffer震荡2～3 min混匀，放置磁力架中5 min，倒掉上清；分别用600 μL洗脱液离心5 min混匀，放置磁力架中5 min，倒掉上清。最后，每孔加入50 μL Elution Buffer 1 300 r/min，70 ℃，20 min，放置于磁力架中获得DNA溶液。DNA质量检测是通过Qubit 4荧光定量仪上测定DNA浓度和总量，吸光度(A)260/280在1.8～2.0。

1.2.2cDNA合成及文库构建 采用华大基因BGI NIFT检测试剂盒的建库方法构建cDNA文库，具体步骤如下：对血浆提取的DNA通过末端修复、接头连接、PCR扩增进行文库制备；制备阴性对照和阳性对照混合液，分别取38.5 μL分子级水，再分别加入1.5 μL阴性对照品、阳性对照品，充分混匀。制备10.0 μL末端修复液，其中末端修复酶0.6 μL，末端修复缓冲液9.4 μL。将上述PCR管加入10 μL末端修复混合液，充分混匀，瞬间离心，置于PCR仪上，37 ℃孵育10 min，冷却至4 ℃保存；接头连接采用磁珠法，将总体积30 μL的连接反应混合液(24 μL连接缓冲液，1 μL连接酶和5 μL标签接头)加入PCR管内，置于PCR仪上23 ℃孵育20 min，冷却至4 ℃保持；再将PCR管过磁力架，弃掉上清液后，加入200 μL 75%乙醇，吹打混匀，过磁力架至溶液澄清，弃掉上清；加入23 μL洗脱缓冲液，充分混匀，室温静置5 min，置于磁力架3 min至溶液澄清，取21 μL上清液于新PCR管中。PCR反应程序为：98 ℃，2 min，1个循环；98 ℃，15 s，56 ℃，15 s，72 ℃，30 s，12个循环；72 ℃，5 min，1个循环，4 ℃，保存。以文库浓度≥2 ng/μL为合格标准。

1.2.3上机检测 对构建好的cDNA文库经纯化合格后，使用BGISEQ-50测序平台测序。

2 结 果

2.1测序质量质控分析 每次检测样本测序有效数据量不少于3.5 M条DNA序列，每次检测结果同时满足阴性对照品检测为阴性，阳性对照品检测为阳性结果。扩增循环数设定为45个循环，随着循环数增加，唯一比对测序条带数>2.5 M，Q20达到95%以上，Q30均达到90%以上，GC%含量在38%～42%，可见数据质控合格，可以进行下一步结果分析，见图1。

注：A表示基因芯片参数；B表示基因序列读取结果；C表示标签拆分率。

图1测序质控图

表1 GDM组和健康对照组孕妇胎儿游离DNA文库浓度比较(ng/μL)

2.22组孕妇外周血胎儿游离DNA文库浓度比较 GDM组孕妇和健康对照组孕妇胎儿游离DNA文库浓度分别为(17.60±0.70)、(18.20±0.35)ng/mL，2组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.32组孕妇外周血胎儿染色体拷贝数结果分析 采用Z检验验证GDM组与健康对照组，结果显示，当阳性判断值判断为3时，显著性水平P<0.01，Z<3，可判定为阴性，并且GDM组和健康对照组间染色体拷贝数无明显差异。见表2。

表2 GDM组和健康对照组孕妇胎儿游离DNA染色体非整倍体拷贝数及风险值

3 讨 论

关于GDM的发病机制学说众多，有遗传易感学说、胰岛素抵抗学说、氧化应激学说、细胞因子分布及表达异常学说等，其中，胰岛素抵抗(IR)普遍被认为是导致GDM发生发展的主要机制[6-7]。大量研究表明，糖尿病是一种多基因病，GDM是糖尿病中的独立类型，对孕妇和胎儿均存在重大影响，GDM不仅与生理性代谢相关，起决定性作用的仍然是易感基因和致病相关基因[8-10]。因此，本研究旨在通过检测GDM孕妇外周血胎儿游离DNA变化，分析基因表达水平是否正常，为诊断和阐明GDM及其遗传效应提供依据。

近年来，国内外广泛提出了“精准医疗计划”，特别是伴随着高通量测序技术的发展，基因测序的成本日益降低，基因测序技术日渐在肿瘤检测、液体活检和产前诊断等诸多领域凸显重要价值和应用前景[11-13]。本研究中通过华大基因BGISEQ-50测序仪，采用联合探针锚定聚合技术(cPAS)和DNA纳米球(DNB)技术，将DNA分子锚与荧光探针在DNB纳米球上进行聚合，并产生荧光信号，然后通过高分辨率成像系统对光信号进行拍照采集，光信号经过数字化处理后即可获得碱基序列。其中，DNB 通过线性扩增的方法进行增强信号，这种方法可以有效降低单拷贝的错误率[14]，十分有效地保证测序过程的准确。本实验均设置对照组及质控，测序结果显示有效测序量达到5 M以上，测序饱和量均达到要求，两组Q20和Q30均分别高于90%以上，GC含量均在50%范围内，由此证明测序结果十分可靠。

正常母亲和胎儿的染色体基因在表达水平上是相同的，如果出现孕妇或胎儿染色体基因表达水平异常，那么可能与一些先天性疾病发生密切相关。汤冬玲[15]的研究表明，GDM就可能与基因表达水平异常直接相关，游离胎儿DNA水平的升高可能与GDM的病理变化使胎盘屏障不完善，胎儿有核细胞进入母体量增多有关。因此，孕妇外周血中胎儿DNA水平的改变可作为辅助诊断及预防 GDM的一项有效指标。本研究采用无创孕妇外周血游离DNA测序技术，理论上可以通过检测游离在母体外周血的胎儿DNA来检测胎儿的遗传物质，从而实现无创零风险的遗传检测。已有大量报道显示，无创DNA检测技术准确性高，基本接近产前诊断的准确性，具有非侵入性、无流产风险的优势，其综合先进的生物信息学分析技术，准确检测出常见胎儿染色体非整倍体异常[16-18]。本研究显示，GDM组孕妇胎儿游离DNA文库浓度并无显著异常，但进一步通过染色体非整倍体变异分析发现个别在18号染色体基因拷贝数存在微重复，但是否与糖尿病致病相关仍有待实验进一步验证。

4 结 论

本研究通过高通量技术揭示，GDM孕妇外周血胎儿游离DNA无明显异常，染色体基因拷贝数无明显差异，为进一步研究GDM形成的分子机制和临床诊断奠定了基础。