尹凌凡，王梦洁，熊建辉，孙黎辉

(深圳市龙岗区中医院/北京中医药大学深圳医院检验科，广东深圳 518111)

乙型病毒性肝炎是一种世界性的传染病，其发病机制极为复杂，病变主要由细胞免疫异常所致，与体内多种免疫细胞的相互作用有关。在病毒清除和肝脏的炎性反应中，乙型肝炎病毒(HBV)特异性T淋巴细胞是主要的效应细胞，而CD8+T淋巴细胞在控制HBV复制和免疫介导的肝损伤中发挥重要作用[1]。其中，γδT和细胞毒性T细胞17(Tc17)细胞群在乙型肝炎的发病、转归和治疗中起到的作用，在近年来逐渐引起重视。乙型病毒性肝炎的治疗，目前主要通过抑制病毒复制和改变机体免疫状态2个方面来进行[2]。机体免疫细胞的免疫状态对于慢性乙型肝炎e抗原(HBeAg)转换方向及预后有很大的影响,HBeAg是HBV在体内活跃复制的标志之一，HBeAg的血清学转换标志病毒复制减少，免疫耐受性减弱或病变静息等变化[3]。本研究通过观察慢性乙型肝炎患者外周血γδT和Tc等细胞群免疫指标与HBeAg转换之间的关系，来了解慢性乙型肝炎患者的细胞免疫状态及在疾病转归方面的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年12月至2018年4月90例在本院肝病门诊就诊的乙型肝炎患者作为研究组，选取同期体检的30例健康者作为对照组。研究组患者中男47例，女43例，年龄26～61岁，平均年龄为(45.7±5.6)岁。对照组中男16例，女14例，年龄25～60岁，平均年龄(45.9±5.1)岁。本研究已通过本院伦理委员会批准。2组研究对象自愿参与本研究，并同意对其进行随访。研究组纳入、排除标准：患者年龄在18岁以上，临床诊断均符合2015年中华医学会肝脏病分会制订的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]，既往乙型肝炎病史或HBsAg阳性超过6个月，现乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV-DNA阳性，HBeAg为持续阴性或阳性，丙氨酸氨基转移酶(ALT)持续或反复异常或肝组织学检查有肝炎病变；同时排除合并其他类型的病毒性肝炎、HIV感染、酒精性肝病、自身免疫性疾病等，无既往病史。健康对照组排除标准：无糖尿病、结核病、自身免疫性疾病和近期感染史;无肝炎症状和体征，血压正常，心肺功能正常；HBsAg阴性，抗丙型肝炎病毒(HCV)阴性。研究组亚组分析： 乙型肝炎患者HBeAg转换，即HBeAg的血清学转换定义为HBeAg转阴且HBeAb转阳[2]。进一步将研究组根据HBeAg血清学转换情况分为3组：HBeAg+/Ab-组(n=30)，即未出现e抗原转换者；HBeAg+/Ab+组(n=30)，即处于转归中间态者；HBeAg-/Ab+组，即e抗原转换者(n=30)。

1.2主要试剂材料 APC-γδT抗体、APC-H7-CD3抗体、PerCP-Cy5-CD8抗体、PE-IL17抗体、FITC-IFN-γ抗体、FITC-CD4抗体、PE-CD4抗体、PE-CD25抗体、AF647-CD127抗体、刺激剂BD Golgiplug及相匹配的对照抗体均购自BD Pharmigen 公司。流式细胞仪BD FACS Canto Ⅱ购自美国BD公司。全自动生化分析仪贝克曼AU5800购自美国贝克曼库尔特公司。

1.3细胞培养、染色和流式分析 所有受试者空腹8 h以上，次日清晨抽取外周静脉血分别注入无菌普通管和肝素抗凝管，普通管静脉血半个小时内离心(3 600 r/min,10 min,25 ℃)取上清，PCR方法检测血清内HBV-DNA含量。取2 mL肝素抗凝全血与2 mL PBS混合，缓缓注入装有2 mL Ficol分离液的试管中，进行密度梯度离心(2 000 r/min,20 min,20 ℃)，吸取单个核细胞层细胞加入10 mL PBS充分洗涤(1 500 r/min,5 min,20 ℃),用RPMI1640完全培养液调整外周血单个核细胞(PBMC)水平为2×109/L。在培养基中加入BD刺激剂4 μL/管，置于CO2培养箱37 ℃培养6 h。刺激后的PBMCs 重悬成15 μL反应体系，加入APC-H7-CD3 抗体2.5 μL、PerCP-Cy5-CD8抗体 8 μL、APC-γδT抗体 5 μL，经胞外染色、破膜，以50 μL反应体系加入PE-IL17抗体10 μL、FITC-IFN-γ抗体1 μL进行胞内染色，后在流式细胞仪(BD FACS CantoⅡ)上对γδT细胞、IL-17+γδT细胞、IFN-γ+γδT细胞、IL-17+CD8细胞等进行分析。

1.4血清ALT水平检测 所有受试者空腹8 h以上，次日清晨采集静脉血约10 mL，采用贝克曼AU5800全自动生化分析仪及其配套试剂检测受试者血清ALT水平。ALT水平正常值为<40 U/L；反之则提示ALT异常。

2 结 果

2.1研究组和对照组PBMCs中IFN-γ+γδT细胞、IL-17+γδT细胞、IL-17+CD8细胞及γδT细胞水平对比 研究组IFN-γ+γδT细胞、γδT细胞水平、IL-17+CD8细胞要明显高于对照组(P<0.05)，而IL-17+γδT细胞与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 研究组和对照组的γδT细胞及其亚群的对比结果

2.2慢性乙型肝炎患者HBeAg/Ab不同表达组PBMCs内IFN-γ+γδT细胞、 IL17+γδT细胞、IL-17+CD8细胞及γδT细胞水平对比 单因素方差分析结果显示，IFN-γ+γδT细胞、IL-17+CD8细胞、γδT细胞3个指标整体差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较结果显示，研究组中，HBeAg+/Ab-组和HBeAg+/Ab+组患者PBMCs内总γδT细胞水平要显著高于HBeAg-/Ab+组(P<0.05)，而在HBeAg+/Ab+和 HBeAg+/Ab-组之间差异无统计学意义(P>0.05)；HBeAg+/Ab+组乙型肝炎患者IL-17+CD8细胞明显高于另外2组(P<0.05)。见表2。

表2 研究组中不同HBeAg/Ab表达组间γδT细胞和CD8细胞及其亚群的对比结果

注：与HBeAg+/Ab-组比较，aP<0.05；与HBeAg+/Ab+组比较，bP<0.05。

2.3慢性乙型肝炎患者HBeAg/Ab不同表达组血清内HBV-DNA水平对比 单因素方差分析结果显示，HBeAg/Ab不同表达组中，ALT正常者、ALT异常者2个亚组及汇总合计的HBV-DNA水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。两两比较结果显示，HBeAg+/Ab-组慢性乙型肝炎患者血清内HBV-DNA水平要明显高于HBeAg+/Ab+组和HBeAg-/Ab+组(P<0.05)。见表3。

表3 研究组中不同HBeAg/Ab表达组HBV-DNA水平对比(拷贝/毫升，

注：与HBeAg+/Ab-组比较，aP<0.05；与HBeAg+/Ab+组比较，bP<0.05。

3 讨 论

根据《慢性乙型肝炎防治指南》(2015版)[4]，以HBeAg+转化为HBeAb+的血清学转换作为临床慢性乙型肝炎患者治疗有效的满意状态，说明乙型肝炎病毒的病变及免疫清除呈现静止状态，同时患者血清内的HBV-DNA含量能够反映乙型肝炎病毒复制的程度。慢性乙型肝炎发病机制目前仍未完全阐明，一般认为，HBV虽未直接杀伤肝细胞，但却可以引发异常的免疫应答，导致肝细胞的损伤和炎症的发生。研究表明，淋巴细胞介导的免疫功能紊乱、免疫调节细胞及其相应的细胞因子的产生在这一病理损伤过程发挥重要的作用[5]。一方面，这种免疫应答过程对疾病的恢复及病毒的清除有一定的促进作用；另一方面，因为调节因子的不平衡又可以导致免疫系统对HBV感染细胞的应答而致使肝脏损伤[6]。固有免疫在HBV感染初期发挥作用，而特异性免疫应答在感染持续过程中发挥主要作用。

γδT细胞是参与固有免疫应答和诱导特异性免疫应答的重要细胞群[7]，其可直接识别蛋白质或抗原肽，具有迅速激活的动力学特征，可快速、有效地发挥免疫调节和应答作用。根据结构的不同，γδT细胞可分为Vγ1、Vγ2和Vγ3这3个亚型。根据功能的差异，又可将γδT细胞划分成IFN-γ的γδT细胞(IFN-γ+γδT)、产生IL-17的γδT细胞(IL-17+γδT)和调节性γδT细胞等亚群[8]。 IFN-γ+γδT细胞可以生成IFN-γ，介导细胞毒效应，在抗细胞内病原体感染中发挥重要作用。IL-17+γδT细胞可以分泌IL-17，刺激细胞产生多种细胞因子，清除病原体并介导炎性反应。CONROY等[9]的研究显示，与对照组相比，无症状的慢性持续性乙型肝炎患者具有较高的Vγ1、Vγ2。另外，无症状患者组的Vγ2细胞表达更高水平的IFN-γ，提示IFN-γ+Vδ2细胞可能在慢性乙型肝炎病情控制中发挥重要作用。

本研究显示，γδT细胞在慢性乙型肝炎患者PBMC中的比例显著增高，提示γδT细胞的异常表达参与慢性乙型肝炎疾病的发生发展。另外，实验数据也显示，研究组IFN-γ+γδT明显高于对照组，但IL-17+γδT在研究组和对照组差异不明显。提示γδT细胞可能主要通过IFN-γ的细胞免疫应答调节作用参与慢性乙型肝炎的进程，考虑可能的机制为IFN-γ+γδT细胞通过生成IFN-γ，诱导机体细胞免疫反应，促进效应细胞活化和增殖，对乙型肝炎病毒的清除具有种重要作用[10-11]。此外，在患者研究组内可以观察到γδT在HBeAg+/Ab+组与HBeAg-/Ab+组表达具有显著差异，而在HBeAg+/Ab+和 HBeAg+/Ab-组间多无显著性差异，提示γδT细胞在慢性乙型肝炎中HBeAg的血清学转换作用，且其效应可能发生在血清转换过程的后期。而IFN-γ+γδT在研究组之间并无差异，提示γδT细胞在HBeAg转换的作用并非IFN-γ+γδT亚群引起的，可能有其他机制，考虑γδT细胞可能通过其分泌的其他细胞因子或参与的信号通路对HBeAg进行血清学转换，这需要进一步的研究。

既往研究显示，产生IL-17的细胞在多种疾病的发病机理中发挥着重要作用[12]。除了CD4细胞(Th17)外， CD8细胞也可以分泌IL-17，此类细胞被称为“Tc17”细胞[13]。Tc17的主要功能是通过分泌IL-17、TNF和IL-22等细胞因子发挥促炎作用。与Th17细胞相似，Tc17也是一种可塑性极强的细胞，可转化为分泌IFN-γ的类似Tc1细胞，发挥细胞毒作用[14]。

王娟华等[15]的研究显示，重度肝损伤患者组的Tc17明显低于轻度和无肝损伤患者组。此外，在对丙型肝炎患者的研究中也发现，在低炎症活动的丙型肝炎患者的IL-17+CD8细胞明显高于高活动性的患者，提示IL-17+CD8细胞，即Tc17细胞可能对肝炎患者起着某种保护作用[16]。本研究进一步对研究组不同分组进行比较，发现在处于转归中间态的HBeAg+/Ab+组中可以观察到IL-17+CD8水平与转化前后的HBeAg+/Ab-和 HBeAg-/Ab+组有显著性差异，提示HBeAg/Ab的系统转化过程与Tc17这一具有细胞毒性的T淋巴细胞密切相关。IL-17+CD8细胞的升高，提示Tc17细胞可能通过分泌相关细胞因子，如IL-17等募集、激活效应细胞至炎症部位，促进乙型肝炎保护性抗体的产生，清除病原体，对肝炎患者肝脏进行保护。Tc17细胞的升高预示HBeAg/Ab的正向转换的可能性增大，从而对乙型肝炎的病情具有一定的动态监测作用。

复制病毒与宿主之间免疫损伤的反应为肝损伤，患者体内的HBV-DNA含量能够反映患者体内病毒的复制情况，就本研究结果来看，HBeAg+/Ab-组慢性乙型肝炎患者血清内HBV-DNA水平要明显高于HBeAg+/Ab+组和HBeAg-/Ab+组，而HBeAg+/Ab+组的HBV-DNA也低于HBeAg-/Ab+组，但差异无统计学意义。提示随着HBeAg血清学转换的进程，HBV的复制程度及传染性强度随之下降；γδT和Tc17的水平在一定程度上能够预测患者体内HBV的复制情况。

本研究仍然存在样本数量较少，研究不够透彻等缺点和其他待解决的问题，γδT细胞对HBeAg血清学转换的作用机制尚不明确，为此，笔者将会继续进行大样本详细分析，争取进一步深入研究乙型肝炎患者PBMC中IFN-γ+γδT细胞、 IL17+γδT细胞数量及γδT其他亚群与血清中HBeAg/Ab之间的相关性及其临床意义。

4 结 论

综上所述，血清中呈现HBeAg+/Ab+的慢性乙型肝炎患者外周血内γδT和Tc17的水平较高，其理论在临床上能够帮助乙型肝炎患者进行早期、及时的诊断，患者能受到更有效的治疗。乙型肝炎患者体内Tc17的频率变化对抗病毒治疗的应答具有预测意义，对临床上乙型肝炎的治疗起到一定的促进作用。