曹 蕾 魏秀芹 刘建华 沈倩影 马 超 薛 梅 张梦巧 高 磊 郑玉峰 高 强

慢性便秘是一种临床较为常见的下消化道功能紊乱性疾病，世界范围内便秘的患病率约为16%，我国成年人便秘患病率为7.0%～20.3%[1]。便秘与肛门直肠疾病，如痔、肛裂和直肠脱垂等关系密切，并且慢性便秘在结直肠癌等疾病的发生中可能起重要作用；另外便秘患者用力排便可诱发心脑血管事件；慢性便秘患者经治疗后症状缓解不明显，反复就医可出现心理情绪障碍，导致生活质量下降[2-3]。慢性便秘可以分为器质性和功能性便秘。慢性功能性便秘的具体病理生理学机制尚未得到完全阐明。最近研究[4-5]表明，炎症介质参与功能性便秘的病理生理学过程。白介素(interleukin, IL)-17A和IL-18是两种促炎因子，在消化道炎症和肿瘤等多种疾病中发挥重要作用[6-8]。但 IL-17A和IL-18在功能性便秘患者结肠黏膜内的表达情况少有报道，本研究对慢性功能性便秘患者的结肠黏膜内IL-17A和IL-18表达情况进行检测，旨在分析其在慢性功能性便秘发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年10月至2019年6月河南科技大学第一附属医院消化内科门诊就诊的32例慢性功能性便秘患者作为试验组。其中男性13例，女性19例，年龄24～74岁，平均(51.6±12.4)岁，病程0.5～19 年，平均(4.3±4.2)年; 并选取同期在本院进行体检的30例健康者作为对照组，其中男性15 例，女性15例，年龄34～71 岁，平均(52.2±10.5)岁。两组患者性别、年龄等一般情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。试验组纳入标准：①所有患者临床诊断符合2016 年罗马IV标准中关于慢性功能性便秘的诊断标准[9-10]；②病程≥3个月，经结肠镜等检查无结肠器质性疾病和肿瘤，近1个月内未服用其他影响胃肠动力的药物。试验组的排除标准包括下列的①和②，对照组的排除标准仅为下列的②：①肠道器质性病变造成便秘的患者；②合并有恶性肿瘤、心肝肾肺等重要脏器严重病变患者，血液、免疫、内分泌和神经系统疾病患者；哺乳、妊娠等特殊时期功能性便秘患者。两组研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂 总RNA提取试剂TRIzol Reagent购于美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒和实时定量聚合酶链式反应(real time-polymerase chain reaction, RE-PCR)试剂盒购于Takara公司，PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成(见表1)。结肠黏膜内IL-17A和IL-18蛋白水平检测使用美国艾博抗(上海)贸易有限公司IL-17A ELISA试剂盒 (ab83688) 和美国Invitrogen 公司IL-18酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(Catalog no: KE00025)进行。

表1 引物序列

1.3 临床取材 两组研究对象均填写基本情况登记表，每例研究对象肠镜检查前均采用复方聚乙二醇电解质散行肠道清洁。肠镜下钳取3块乙状结肠黏膜活检组织：1块组织放入10%甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋后切片，切片厚度为4 μm，常温保存以备 HE使用；另1块组织用做实时定量PCR测定组织中mRNA，首先加入RNAlater以保护mRNA不被降解，然后放置4℃环境24 h后，转移到-80℃冰箱保存；第3块组织用于ELISA方法测定组织中蛋白含量，直接放入-80℃冰箱保存备用。

1.4 组织学观察 对常规HE染色切片使用光学显微镜(奥林巴斯公司，日本)进行观察，对比两组研究对象结肠黏膜结构情况，上皮细胞和基底膜完整性，以及黏膜下层结构和炎性细胞浸润情况。每例切片随机选2个视野进行观察，记录观察结果。

1.5 实时定量PCR检测结肠黏膜内IL-17A和IL-18 mRNA水平 RT-PCR检测结肠黏膜IL-17A和IL-18 mRNA表达水平。取200 mg结肠组织，放到无RNase的1.5 mL离心管中，采用Trizol法提取总RNA，用核酸定量仪测定RNA纯度和浓度。取总RNA 2 μg，按照逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，-20℃保存备用。在冰上配制PCR反应液，25 μL反应体系包括cDNA 2 μL，SYBR Premix EX TaqⅡ (2×) 12.5 μL，DEPC水8.5 μL和上下游引物各1 μL。在BIO-RAD Real-time PCR仪中进行PCR反应，反应条件为: 95oC预变性30 s，95oC 5 s、58oC 30 s、95oC 15 s，共40个循环。结果以阈循环 (Ct) 值表示，18srRNA作为内参基因，每个样本3个复孔，各样本的待测基因扩增量与18srRNA基因扩增量采用Log10 (2-ΔΔCt) 法分析mRNA相对表达量。平均Ct值>35，视为该目标基因无表达。

1.6 ELISA检测结肠黏膜内IL-17A和IL-18蛋白水平 预冷 RIPA蛋白抽提试剂，加入酶抑制。在蛋白抽提开始前加入0.1M PMSF母液。Fluka 电动组织匀浆器15 000 r/min转速进行匀浆，每次10 s转速进行匀浆，间隔10 s进行3次。匀浆时EP管需要浸入冰水混合物中进行降温。匀浆完成后在冰上孵育20 min、4oC、13 000 r/min离心，离心完成后取上清，分装保存待测。ELISA检测操作按照厂家说明书要求进行，检测线性范围均为20～480 pg/mL。美国美谷分子 (Molecular Devices) 酶标仪读取数值。

2 结果

2.1 两组研究对象结肠黏膜HE染色情况比较 试验组和对照者结肠黏膜的HE染色结果均未发现形态学异常，未见到明显淋巴细胞或单核细胞等炎症细胞浸润等。见图1、表2。

图1 试验组和对照组结肠黏膜活检情况(HE染色×200)

表2 结肠黏膜活检情况

2.2 两组研究对象结肠黏膜内IL-17A mRNA和IL-18 mRNA表达水平比较 试验组结肠黏膜中IL-17A mRNA的表达水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而IL-18 mRNA表达水平比较，两组差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 结肠黏膜内IL-17A和IL-18 mRNA表达水平比较相对表达倍数)

2.3 结肠黏膜内IL-17A蛋白和IL-18蛋白水平比较 试验组结肠黏膜中IL-17A蛋白在结肠癌的黏膜中表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，IL-18蛋白两组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 结肠黏膜内IL-17A和IL-18 蛋白表达水平比较表

3 讨论

慢性功能性便秘是一种临床常见的疾病，其发病机制的是多种病理生理因素参与，但具体病理生理学机制尚未得到完全阐明，目前认为便秘与遗传因素、饮食中纤维素摄入少、活动量少、肠道菌群结构变化以及肠道神经化学信号物质如P物质和5-羟色胺等多种因素有关[11-12]。

本研究发现，炎症介质IL-17A mRNA和蛋白在功能性便秘患者肠道黏膜内的表达水平明显升高。细胞因子IL-17A是IL-17家族中6个成员(IL-17A-F)的成员之一，是一种具有多种功能的细胞因子，主要由Th17细胞等细胞分泌，在急慢性炎症、自身免疫反应和肿瘤免疫中发挥重要作用。IL-17A 通过促进细胞因子、化学趋化因子和基质金属蛋白酶等炎症物质参与炎症的过程，并有维持黏膜屏障等保护作用[13]，IL-17A参与肠道炎症过程[14]。Mokhtare 等[5]在研究老年便秘患者细胞因子与便秘的关系时发现，血清中IL-1、IL-6和TNF-α明显高于正常对照组。Cirali等[4]发现，在儿童便秘患者血清中IL-6和IL-12水平升高，他们认为患儿存在亚临床炎症。在动物实验研究中，应用苍术素(Atractylodin)缓解肠道便秘和腹泻症状是通过它的抗炎作用实现的[15]。结合这些临床和动物研究结果表明炎症参与便秘的发病机制，适当地控制炎症有可能成为治疗便秘的方法之一。在本研究中，从组织学HE染色结果来看，并没有发现便秘结肠黏膜明显的组织病理学的改变，也没有发现淋巴细胞或单核巨噬细胞等炎性细胞增多，提示结肠组织明显的炎症表现。在本实验中由于没有进行细胞学鉴定和原位杂交以确定IL-17A mRNA的细胞来源，IL-17A表达水平增多的原因和细胞来源还待进一步研究。

IL-18主要由单核巨噬细胞系细胞分泌，细菌内毒素脂多糖有促进IL-18的作用[16]。作为一种促炎因子IL-18具有多种功能，参与肠道炎症过程，具有促进白细胞聚集、增加黏膜通透性的作用，IL-18在炎症性肠病中作用已经有较为深入的研究[17]。本研究中，IL-18 mRNA和蛋白水平在功能性便秘患者肠道黏膜内的表达水平未见明显变化，组织学HE染色也没有发现单核巨噬细胞等炎性细胞增多。IL-17参与功能性便秘发病的炎症机理中，而IL-18则可能没有参与，原因需要进一步研究。Yoon等[18]应用益生菌治疗慢性功能性便秘，研究结果显示益生菌可以有效地改善便秘症状，然而并未发现TNF-α血清水平有所改变，这说明在功能性便秘发病机制中不同的IL发挥的作用存在差异。

综上所述，IL-17A mRNA和蛋白在功能性便秘结肠黏膜中表达升高，提示IL-17A可能参与功能性便秘的发病机理或病理过程，而IL-18没有参与。由于本次研究的样本量较少，没有进行便秘临床分型，测定的炎症介质种类不多，也没有进行细胞学定性，不能全面反映炎症介质在功能性便秘中的作用。系统全面的、大样本的深入研究应该进行以进一步全面明确炎症介质与功能性便秘关系，为临床治疗功能性便秘结提供依据。