李亚妃， 赵 犇， Martha Daniel Mbifile， 杨海麟， 王 武*

（1． 江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122；2. 江南大学 工业微生物教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

二十二碳六烯酸 （docosahexenoic acid， 简称DHA），属于ω- 3 型长链多不饱和脂肪酸，对婴儿视力发育和儿童智力发育起重要作用， 对高血压、关节炎、成人糖尿病、抑郁、动脉粥样硬化、血栓形成和某些癌症有预防效果[1-5]。 作为DHA 生产菌株，裂殖壶菌（破囊壶菌科，Schizochytriumsp.）生长快，产油高，DHA 含量高， 菌体是一种安全的食品添加剂，已成为工业化生产DHA 的优秀菌种之一[6-10]。无机盐中的金属离子是微生物体内一些酶的辅基，参与调节酶的结构和活性，调节细胞膜通透性，对于属于海洋真菌的裂殖壶菌有明显影响[11]。 生长素是一类能以极低的浓度来调节植物的生理过程的微量活性物质，对破囊壶菌（T. roseumMF2 ）和裂殖壶菌的生长和产DHA 有很大影响[12-13]。作者首先分别研究了无机盐和生长素类植物激素对裂殖壶菌生长和产油的影响， 确定FeSO4对裂殖壶菌的生长有显著促进作用，吲哚乙酸（Indolebutyric acid，简称IBA）则对裂殖壶菌生长和产DHA 有明显提高。 在此基础上进行了FeSO4和IBA 的两因素、三水平的响应面中心组合试验设计， 旨在探究FeSO4和IBA的组合添加对裂殖壶菌生长、 产油和DHA 含量的影响，得到组合添加FeSO4和IBA 培养裂殖壶菌产DHA 的最佳培养方案。 最后在7.5 L 发酵罐中分别进行了对照组和优化后发酵策略的放大实验，探究FeSO4和IBA 对裂殖壶菌发酵周期中各阶段的影响。

1 材料与方法

1.1 菌种

裂殖壶菌Schizochytruimsp.AB-610，由作者所在实验室ARTP 诱变获得， 于-40 ℃保存于20%甘油管中。

1.2 培养基

种子培养基：30 g/L 葡萄糖，10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，溶于50%人工海水中。 人工海水配方由作者所在实验室在基础上优化所得：11 g/L NaCl，0.8 g/L KCl，1.22 g/L MgCl2，0.71 g/L CaSO4，0.93 g/L MgSO4。

发酵培养基：100 g/L 葡萄糖，4 g/L 胰蛋白胨，18 g/L MgSO4，20 g/L 谷氨酸钠，2.5 g/L KH2PO4，0.4 g/L CaCl2，蒸馏水与人工海水按体积比1∶1 混合。

1.3 培养方法

1.3.1 摇瓶种子培养接种1 mL 甘油管菌种于种子培养基中，200 r/min、28 ℃下培养48 h 为一级种子液。将一级种子液以10%接种体积分数接入100 mL 种子培养基中，200 r/min、28 ℃下培养24 h 为二级种子液。

1.3.2 摇瓶发酵方法将一级种子液以10%接种体积分数接入100 mL 发酵培养基中，200 r/min、28 ℃下培养5 d。

1.3.3 补料分批发酵方法将二级种子液以10%接种体积分数接入载有3 L 发酵培养基的NBS110型7.5 L 发酵罐中， 中后期维持葡萄糖质量浓度在一定范围内，调控pH 为6.8，400 r/min、28 ℃下培养5 d，进行补料分批发酵。

1.4 测定方法

1.4.1 菌体干质量测定取10 mL 发酵液于已称质量的离心管中，于8 000 r/min 离心15 min，弃上清液，再以去离子水清洗菌体，置于60 ℃干燥箱中烘干至恒质量，称质量。

1.4.2 裂殖壶菌油脂提取取20 mL 发酵液于旋塞离心管中，于8 000 r/min 离心15 min，弃上清液，再以去离子水清洗菌体。 以去离子水定容至5 mL，加入8 mL 盐酸，加入玻璃珠混匀，70 ℃水浴2 h。加入20 mL 正己烷，混匀，取上层有机层于已称质量的蒸馏瓶中，于55 ℃真空旋转蒸发至恒质量，称质量。

1.4.3 油脂中脂肪酸组成测定脂肪酸甲酯化及脂肪酸组成测定参照文献[9]。

纵观张岱家族，从张天复、张元忭经过张汝霖到张岱，都十分欣赏徐渭的才学。从送马金囊、短袖皮袄和菽酒，鼎力帮其出狱，到编写《会稽县志》，天复、元忭父子主要通过生活上、行动上体现了对徐渭的关爱，而张汝霖、张岱祖孙俩，则通过写文辑书的方式表达了他们对徐渭的敬意。

1.4.4 发酵液中葡萄糖质量浓度测定取发酵液1 mL，于8 000 r/min 离心15 min

，取上清液用去离子水稀释至适当质量浓度， 利用SBA-40B 型生物传感分析仪测定葡萄糖质量浓度。

2 结果与讨论

2.1 无机盐分别对Schizochytruim sp.AB-610 生长和产DHA 的促进作用

分别选择了ZnSO4、MnCl2、FeSO4进行实验，三组实验所得结果中以生物量为标准所确定的最优添加量及其对应的发酵结果见表1。

表1 ZnSO4、MnCl2、FeSO4 对Schizochytruim sp.AB-610 生长和产油的影响Table 1 Effects of ZnSO4、MnCl2、FeSO4 on DCW/lipids/DHA in Schizochytruim sp.AB-610

ZnSO4抑制了Schizochytruimsp.AB-610 生长，在添加了ZnSO4的实验中， 菌体生物量下降了10.7%，油脂产量和DHA 产量亦有所下降。Zn2+对包括糖酵解途径中的一些重要酶促反应有抑制[14]，推测可能是Zn2+影响了Schizochytruimsp.AB-610 中的能量代谢，从而影响了细胞的生长和产油。

MnCl2对细胞生长和DHA 产量无明显影响，而对胞内油脂产量有所抑制， 使得油脂内DHA 质量分数提高了10.6%。 根据MnCl2组实验数据分析发现添加量在24~48 mg/L 时， 胞内油脂含率逐渐降低，而油脂内DHA 质量分数逐渐提高。 裂殖壶菌利用NADPH 和乙酰辅酶A 通过不同的代谢途径合成饱和脂肪酸和与多不饱和脂肪酸（DHA、DPA、EPA）[15]。基于此，作者推测Mn2+对Schizochytruimsp.AB-610中饱和脂肪酸的合成有明显抑制作用，而对其多不饱和脂肪酸的合成无明显影响。

FeSO4对细胞的生长有显著促进作用， 添加量为1 mmol/L 时菌体生物量较对照组提高了35.7%，FeSO4组实验结果见图1。 通过分析发现，FeSO4对细胞生长和产油的促进作用不同步，1 mmol/L 时对细胞的促进最大， 而在1.5 mmol/L 油脂内DHA 质量分数促进最大，为46.13%，此时生物量为41.03 g/L。

图1 FeSO4 对裂殖壶菌生长和产油的影响Fig. 1 Effect of FeSO4 on biomass，lipids，DHA in Schizochytruim sp.AB-610

基于此，可在后期利用裂殖壶菌发酵周期中发酵特性的变化开展分阶段补加Fe2+的研究。Fe2+作为辅基参与多种酶促反应， 而其对Schizochytruimsp.AB-610 生长的高效促进作用可能是由于其参与了细胞生长、产油中的某些代谢途径，促进了能量代谢。 后续可通过分子生物学手段如转录组学等方法进行Fe2+高效促进Schizochytruimsp.AB-610 细胞生长的机理研究。

2.2 生长素对Schizochytruim sp.AB-610 生长和产油的影响

分别选择了吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）进行实验，三组实验所得结果中以生物量为标准所确定的最优添加量及其对应的发酵结果见表2。

萘乙酸为类生长素，可促进植物细胞分裂与扩大。 实验结果表明，它对Schizochytruimsp.AB-610的生长有一定促进作用，在添加量为1 mg/L 时生物量达到最大，为37.35 g/L，较对照组提高了13.6%。实验同时表明，NAA 对细胞产油和产DHA 产量并无明显影响。

吲哚丁酸对Schizochytruimsp.AB-610 的生长和产油均有明显促进作用，添加量为7 mg/L 时生物量、油脂产量和DHA 产量均达到最大值，结果见图2。推测IBA 不仅促进了细胞的增殖和生长，同时与胞内多不饱和脂肪酸合成途径中的相关酶系有影响，促进了多不饱和脂肪酸的合成，从而提高了胞内油脂中的DHA 质量分数，后续将选择IBA 进一步研究。

表3 中心试验设计与结果Table 3 Experiment design and results of center composite design

2.3 促进因子应用于发酵的响应面法优化

在单因素实验中裂殖壶菌的生物量、油脂产量和油脂中DHA 的质量分数有所提高。 为了进一步提高DHA 生产水平， 在单因素研究的基础上，以FeSO4、IBA 的最佳点作为中心点，在500 mL 摇瓶中进行两因素、 三水平的响应面优化实验， 利用Design -Expert.V8.0.6.1 软件中Center Composite Design 进行实验设计。 设计因素包括A：FeSO4添加浓度、B：IBA 添加质量浓度，因变量包括DCW、油脂产量、DHA 产量，实验方案与结果见表3。

利用Design-Expert.V8.0.6.1 软件分别对油脂产量和DHA 产量进行回归分析与拟合。 油脂产量的回归模型及方差结果见表4。 模型的F=19.9，P=0.000 5。 一般认为当P值小于0.05 时， 模型显著，因此该模型显著。模型失拟项F=1.28，P=0.408 9。一般认为P值大于0.05 时，不显著，因此模型失拟项 不 显 著。 模 型 中B、AB、AC和A2的P值 小 于0.05，说明这些因素显著，A的P值大于0.1，说明不显著。 多元二次回归模型为：

油脂产量=-1.473 63+20.504 67*FeSO4+2.919 09* IBA-10.037 47 *FeSO42-0.244 63*IBA2

表4 油脂产量二次响应面回归模型方差分析Table 4 Analysis of Variance for quadratic response surface regression model of the lipids yield

DHA 产量的回归模型及方差结果见表5。 模型的F=25.82，P=0.000 1。该模型显著，失拟项不显著。模型中B、AB、AC和A2的P值小于0.05，说明这些因素显著，A的P值大于0.1，说明不显著。 多元二次回归模型为：

DHA 产量=-2.917 66+10.660 87* FeSO4+1.887 51*IBA-5.280 94* FeSO42-0.148 83*IBA2

通过所获模型方程对油脂产量和DHA 产量进行整理，得到A：0.95 mmol/L，B：6.5 mg/L，细胞生物量为模型预测值为48.38 g/L， 油脂产量17.59 g/L，DHA 产 量8.43 g/L， 油 脂 中DHA 质 量 分 数 为47.9%。 在该条件下进行三次平行试验，实验结果为生物量（49.23±0.25） g/L，油脂产量（17.73±0.13） g/L，DHA 产量（8.11±0.23） g/L，油脂中DHA 质量分数（47.6±0.2）%。 实验结果与预测值相吻合，见图3。

2.4 添加促进因子后裂殖壶菌发酵的特性

2.4.1 对照组中裂殖壶菌细胞形态变化走势裂殖壶菌生殖方式包括二分裂生殖、孢子生殖和异形体增殖， 作者所在实验室菌株Schizochytruimsp.AB-610 以连续二分裂为主要生殖方式[14]。 在NBS 7.5 L 发酵罐中补料分批发酵下培养Schizochytruimsp.AB-610 5 d，初始装液量3 L，接入体积分数10%预培养的种子液，28 ℃、通气量3 vvm，pH 6.8 条件下对裂殖壶菌进行发酵培养，48 h 开始补加一定葡萄糖， 维持葡萄糖质量浓度在40～50 g/L， 观察Schizochytruimsp.AB-610 发酵周期中各分裂形态细胞（单细胞、二分体、四分体、八分体、多分体和成团细胞）的比例，确定裂殖壶菌发酵周期中细胞所处的时期。

表5 DHA 产量二次响应面回归模型方差分析Table 5 Analysis of Variance for quadratic response surface regression model of the DHA yield

发酵前期，分裂形态细胞占据主体。 二分体比例在6 h 时达到峰值47.4%， 之后八分体细胞则占据主体地位，12～24 h 时， 八分裂细胞比例维持在57%～64%。 单细胞比例在前期（6～18 h）有所下降，在18 h 达到最低值11.1%，中后期则持续上升。 中期分裂形态细胞比例开始下降，单细胞比例持续增高，至66 h 时，单细胞比例超过50%。后期各形态细胞趋于稳定，细胞基本停止分裂活动。 作者在观测时未计入异形体、孢子囊等其他增殖方式的细胞形态，见图4。

图3 Center Composite Design 实验设计下Schizochytruim sp.AB-610 发酵响应面Fig. 3 Results of fermentation of Schizochytruim sp.AB-610 with Center Composite Design

图4 裂殖壶菌发酵周期中各形态细胞比例的变化Fig. 4 Ratio of different morphologic cells during fermentation of Schizochytruim sp.AB-610

由此说明裂殖壶菌发酵过程中，前期菌体以分裂细胞形态为主，细胞快速分裂；中期细胞开始分离，细胞开始变大，逐渐转入产油期，多细胞形态比例减少，细胞分裂速度减慢，至后期细胞基本稳定，无明显形态变化。

2.4.2 裂殖壶菌发酵特性在NBS 7.5 L 发酵罐中补料分批发酵条件下培养Schizochytruimsp.AB-610 5 d，发酵策略同上，每隔12 小时取样，测发酵液中葡萄糖、生物量、油脂产量、油脂中脂肪酸组成。 对照组及添加促进因子后的发酵特性曲线见图5。

分析对照组发酵特性曲线，Schizochytruimsp.AB-610 的补料分批发酵周期中，1） 生物量变化规律：0~24 h 内，菌体量增长缓慢，碳源消耗速率小，24~72 h 菌体量快速增长， 特别在24~48 h 内对碳源的细胞得率（YX/S）最大，细胞平均生长速率为1.19 g/（L·h），80 h 时生物量达到64.6 g/L， 之后生物量缓慢下降。2）油脂含率变化规律：12~48 h 内菌体内油脂含率缓慢下降，而在48~96 h 内迅速上升，96 h时达到最高值40.5%， 之后至发酵结束期间内缓慢下降。 发酵伊始生物量和油脂产量均较低，所得油脂含率误差较大，此处并未分析。 3）油脂内DHA 质量分数：油脂中DHA 质量分数在12~60 h 内持续降低，在60~120 h 内持续缓慢上升，至发酵结束时达到41.13%。至发酵结束时，菌体生物量为64.06 g/L，菌体内油脂含率38.9%， 油脂中DHA 质量分数为41.13%。

结合发酵周期中细胞形态变化趋势，0~24 h内，菌体快速分裂，但代谢速率低，细胞个体仍较小，生物量上升缓慢。 24~48 h 内，细胞仍处于旺盛分裂时期，碳源消耗速率高，细胞得率高，生物量快速增长，细胞数量和个体均处于增长时期。 48~96 h内，细胞二分裂活动逐渐减缓，开始快速积累油脂，且在前期（48~72 h）以合成饱和脂肪酸为主。96~120 h菌体量和细胞活动都趋于稳定，葡萄糖消耗速率和比消耗速率下降， 菌体消耗了自身的一部分油脂，且偏好于消耗饱和脂肪酸。 依据上述特点确定：Schizochytruimsp.AB-610 的补料分批发酵周期中，0~24 h 为菌体适应期，24~48 h 为菌体快速生长期，48~96 h 为油脂快速积累期，96~120 h 则为油脂返耗期。

图5 Schizochytruim sp.AB-610 发酵特性曲线对照组、添加了促进因子组Fig. 5 Fermentation characteristic curve of Schizochytruim sp.AB-610 with control supply FeSO4&IBA

添加促进因子的补料分批发酵中，菌体适应期（0~24 h）， 添加双促进因子的试验组与对照组并无明显区别。 快速生长期（24~48 h），双促进因子的添加有效促进了菌体的生长，试验组的生长速率达到1.51 g/（L·h），较对照组提高了26.7%，至快速生长期结束，试验组的生物量达到49.23 g/L。 油脂积累期（48~96 h）， 试验组细胞的油脂含率略低于对照组，分析原因可能是生物量的提高更多地消耗了培养基中营养元素和溶氧等，一定程度上限制了胞内油脂积累。48~84 h 为产油旺盛期，试验组的油脂积累速率为0.604 g/（L·h），高于对照组的0.454 g/（L·h），这依赖于试验组更高浓度的菌体。 产油期结束时，试验组油脂中DHA 为41.5%，高于对照组，说明双促的添加有利于细胞中DHA 的合成。 油脂返耗期（96~120 h），生物量至108 h 时仍有微弱增长，达到最高值93.03 g/L，说明双促的添加延长了菌体的生长期，后期试验组生物量消耗较对照组大，这可能是试验组生物量基数较大引起的。 至发酵结束时，添加双促进因子的补料分批发酵生物量、 油脂产量、DHA 产量分别为90.56、35.42、15.52 g/L。 DHA生产强度为3.10 g/（L·d），得到了有效提高。

双促进因子的添加可有效地提高Schizochytruimsp. AB-610 快速生长期的生长速率，促进产油期DHA 的合成，对DHA 的产量和生产强度有大幅提高，证明双促进因子的添加对高密度发酵产DHA 同样有显著促进。 同时，本研究并未将发酵技术复杂化，有利于放大生产，同时与其他技术手段相结合， 进一步提高高密度发酵的生产水平，有望提高大规模发酵产DHA 的生产强度。

3 结 语

作者确定了FeSO4可高效促进Schizochytruimsp.AB-610 的 生 长，IBA 对Schizochytruimsp.AB-610 生长和产DHA 均有促进，并利用中心组合实验设计确定了两种促进因子组合添加的最适添加量为FeSO40.95 mmol/L，IBA 6.5 mg/L，摇瓶验证试验中较对照组生物量提高了50.01%，DHA 产量提高了65.17%。 通过初步放大发酵试验证明，添加两种促进因子高效促进了菌体生长，提高了快速生长期细胞的生长速率，延长了菌体增长的时期，至发酵结束时生物量为90.56 g/L， 油脂产量为35.42 g/L，DHA 产量为15.52 g/L， 较对照组均有明显提高，且DHA 的生产强度提高了51.22%。