卜柯丽， 傅卢成， 王灵杰， 栗青丽， 王柯杨， 马元丹,2， 高 岩,2， 张汝民,2

（1. 浙江农林大学 林业与生物技术学院， 浙江 杭州311300； 2. 浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室， 浙江 杭州311300）

自噬（autophagy）是进化上保守的细胞内物质的降解途径， 在真核生物中广泛存在。 与其他降解系统相比， 自噬最显著的特征是能降解细胞中如生物分子、 细胞器甚至入侵的微生物等几乎所有的物质［1］。自噬在饥饿条件下的营养循环中起着重要作用， 能将营养物质重新分配进行物质循环［2-4］。 LI 等［5］对玉米Zea mays研究发现： 自噬在缺氮环境下调控氮回收利用以增加农作物产量； LI 等［6］在谷子Setaria italica中发现： 自噬相关基因SiATG8 在响应氮饥饿耐受中表达上调； AVIN-WITTENBERG 等［7］发现： 碳饥饿条件下自噬能通过降解蛋白质等生物大分子产生氨基酸作为替代性碳源， 供植物体重新利用； 在碳饥饿条件下， 自噬会影响中枢代谢导致拟南芥Arabidopsis thalianaATG（autophagy-related gene）突变体表型与野生型差异明显。 BARROS 等［8］发现： 在碳饥饿情况下， 自噬中的代谢物循环和呼吸的替代途径对维持正常的呼吸功能起作用。 自噬在植物体自身生长和发育中也起着重要的作用［9-10］， 如参与根尖的细胞生长和分化［11-12］、 减数分裂后花药的发育［13］、 气管元素的分化［14］、 对硝酸盐的利用率［9］、 对光合作用产生淀粉粒的降解［15］、 在衰老叶片中叶绿体的降解［16-18］、 植物体衰老过程中能量的利用［19］以及植物夜间生长供能物质的利用［20］等等。 GHIGLIONE 等［21］对小麦Triticum aestivum的研究发现： 自噬对其小花发育过程起到作用； KURUSU 等［13］对水稻Oryza sativa研究发现： 自噬缺陷Osatg7 和Osatg9 突变体在正常生长条件下表现出完全的孢子体雄性不育和有限的花药开裂。 IZUMI 等［19］对水稻的研究发现： 自噬可在叶片变暗引起能量限制时被激活， 对其具有重要的保护作用； TOYOOKA 等［22］对发芽薇甘菊Mikania micrantha种子子叶的超微结构进行观察， 认为微自噬机制可能参与储备淀粉的降解； YOSHIMOTO 等［23］发现：当环境中的营养供应有限时， 植物细胞中的养分调动需要自噬。 WANG 等［15］发现： 细胞自噬能够在夜间对叶片淀粉的降解起作用。 有实验室证实， 自噬可以在晚间为植物提供能量［20］。 毛竹茎秆生长发育过程的研究分析主要在解剖结构［24］、 反射光谱［25］、 光合酶［26-27］、 碳水化合物代谢［28-30］、 蛋白质组［31］、 基因组学［32-33］等方面。 对模式植物拟南芥和水稻中的研究表明： 自噬对植物生长起重要作用［7,15,19-20］， 而在毛竹Phyllostachys edulis中关于自噬与其快速生长关系的研究鲜见报道。 本研究探讨了毛竹茎秆快速生长过程中PeATG1 和PeATG4 基因的表达变化， 以期为毛竹快速生长内在的自噬调控机制及分子生物学基础提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

供试毛竹采自浙江省杭州市临安区（29°56′～30°23′N， 118°51′～119°52′E）现代毛竹纯林示范园。 该区属中亚热带季风气候， 温暖湿润， 四季分明， 年平均气温15.8 ℃， 具有春多雨， 夏湿热， 秋气爽，冬干冷的气候特点。 全年平均日照时数1 847.3 h， 年平均降水量1 628.6 mm, 无霜期234.0 d， 森林覆盖率76.5%。 毛竹林土壤属山地红壤， 土层深度60 cm 以上。

1.2 试验材料

试验材料为2018 年当年生毛竹笋竹， 2018 年5 月初， 在毛竹出笋后生长至（3.0 ± 0.2） m 时， 分别在6 个时间点（10：00、 14：00、 18：00、 22：00、 2：00、 6：00）选取生境条件一致， 生长状况良好， 基径约15 cm 自然状态下的毛竹笋竹， 从茎秆地上部分的基部将其伐倒， 将节间按照从基部至顶部的顺序编号（1～N）。 每间隔2 个节间进行取样， 从基部至顶部依次选取编号为1、 4、 7、 10、 13、 16、 19、 22 的节间。 取茎秆节间下部外层绿色组织， 取样厚度为2 mm， 用于电镜观察样品后， 取下， 迅速将样品放进液氮中冷冻， 存于-80 ℃备用。 选取3 株笋竹， 每株作为1 个独立实验， 共3 次重复。

1.3 测定方法

1.3.1 电镜样品的制备与观察 将笋竹的第4、 7、 10、 13 节间的茎秆切成0.2 mm × 5.0 mm 的小块置于体积分数2.5%戊二醛溶液中， 4 ℃固定24 h。 然后， 将样品置于0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（PBS, pH 7.0）中漂洗3 次， 15 min·次-1， 再置于质量分数1%锇酸中固定2 h。 之后， 用PBS 缓冲液漂洗3 次固定材料后， 使用各级梯度乙醇（体积分数30%、 50%、 70%、 80%、 90%、 95%和100%）脱水处理15 min，过渡到纯丙酮处理20 min； 在45 ℃下用环氧树脂（Epon 812）浸透包埋经脱水处理的材料25 h， 之后在70 ℃条件下加热聚合48 h； 使用LEICA EM UC7 型超薄切片机修整包埋样品并切片， 再分别置于柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液双染色10 min， 在Hitachi H-65 型（日本, HITACHI 公司）电镜上观察， 并拍照记录结果。

1.3.2 引物设计 基于毛竹基因组数据库中PeATG1 和PeATG4 的基因序列设计基因全长和定量引物，选择毛竹PeNTB基因作为荧光定量的内参基因， 并使用在线网站Primer 3 设计引物（http：//bioinfo.ut.ee/primer3/）， 由有康生物科技公司合成（表1）。

表1 本研究所用的引物名称Table 1 PCR primers used in this study

1.3.3 毛竹笋竹总RNA 的分离纯化以及纯度、 完整性检测 分别取适量6 个时间段的毛竹笋竹茎秆第7 节间， 使用改良Trizol 法提取茎秆组织总RNA。 使用NanoDropRND-1000 分光光度计检测样品RNA的含量与纯度， 并通过质量分数1.2%琼脂糖电泳检测样品RNA 的完整性。

1.3.4 cDNA 合成 以上述RNA 为模板， 冰上配置20 μL RT-PCR 体系： 包括gDNA Eraser 1.0 μL， 5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL， RT Primer Mix 1.0 μL， Prime Script RT Enzyme MixⅠ1.0 μL， 5×PrimeScript Buffer 2 （for Real Time） 4.0 μL， 总RNA 500 ng， 加RNase Free dH2O 至总体积20.0 μL。 体系置于PCR仪中， 37 ℃孵育15 min， 85 ℃加热5 s。 将通过反转录得到的cDNA 存于-20 ℃下用于实时荧光定量分析。

1.3.5 笋竹PeATG1 及PeATG4 基因全长cDNA 克隆 根据毛竹数据库PeATG1 和PeATG4 基因序列设计基因全长引物（表1）， 扩增这2 个基因的系列片段， 扩增程序分别为： 94 ℃5 min； 94 ℃30 s， 52 ℃30 s， 72 ℃70 s， 共30 个循环； 72 ℃10 min。 通过质量分数1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，送往有康生物科技公司测序。

1.3.6 自噬相关基因PeATG1 及PeATG4 反转录产物的基因表达分析 采用TaKaRa 公司SYBRRPremix Ex TaqTM（Perfect Real Time）试剂盒， 冰上配置20 μL 反应体系： 10 μL SYBR Premix ExTaqTM， 0.8 μL Forward Primer， 0.8 μL Reverse Primer， 2.0 μL 反转录cDNA 模版， 6.4 μL 灭菌蒸馏水。 反应于Bio-Rad CFX manager 3.1 PCR 仪上进行， 采用两步法扩增标准程序： 95 ℃预变性3 min， 95 ℃下10 s、 60 ℃下30 s， 循环39 次。 以内参为对照， 每个样品重复3 次。 反应完成后， 得到含所有样品的记录点曲线，得出循环阈值（Ct值）。

1.3.7 数据处理 所有数据均为3 次重复， 荧光定量数据按照公式计算： 相对表达量=2-ΔΔCt［34］， 使用内参基因校正拷贝数， 利用Origin 9.0 软件进行统计分析和作图。 统计方法采用单因素方差分析（one-way ANOVA）， 对笋竹PeATG1 及PeATG4 基因表达量分别进行Turkey 比较。

2 结果与分析

2.1 毛竹茎秆快速生长节24 h 自噬活性监测

使用透射电子显微镜监测毛竹茎秆第7 节间组织不同时间段的自噬活性（图1）， 在10：00 和14：00的节间中观察到大量淀粉粒存在， 未发现自噬体（图1A 和图1B）； 在18：00 的节间观察到淀粉粒和自噬体（图1C）； 22：00 第7 节中观察到包裹有淀粉粒的自噬体（图1D）； 2：00 第7 节中观察到经典的双层膜自噬体（图1E）； 6：00 第7 节中未观察到自噬体， 有少量淀粉粒（图1F）。

图1 毛竹茎秆组织自噬形成监测Figure 1 Monitoring of autophagy in stem of P. edulis

2.2 毛竹茎秆快速生长过程夜间自噬活性监测

对毛竹茎秆快速生长节24 h 自噬活性监测发现： 自噬活性在22：00 和2：00 较强， 进一步对22：00 和2：00 的毛竹茎秆不同节间组织第4、 7、 10、 13 节的自噬活性进行监测， 22：00 和2：00 第4 节中未观察到淀粉粒和自噬体（图1G 和图1J）， 第7 节和第10 节中观察到淀粉粒和自噬体 （图1D、 图1E、 图1H和图1K）， 第13 节中均未观察到自噬体， 有大量淀粉粒（图1I 和图1L）。

2.3 毛竹茎秆PeATG1 和PeATG4 基因cDNA 全长克隆及验证

以确定良好纯度和完整度的毛竹茎秆总RNA 的反转录产物cDNA 为模板， 通过普通PCR 扩增PeATG1 及PeATG4 基因全长， 并通过质量分数1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物（图2）， 条带清晰且单一， 获得与预期片段大小一致、 长度分别为392 和1 087 bp 扩增产物。

图2 毛竹PeATG1 及PeATG4 基因cDNA 扩增电泳图Figure 2 Electrophoresis map of PeATG1 and PeATG4 amplification

2.4 毛竹茎秆快速生长过程中PeATG1 基因表达模式

24 h 内毛竹茎秆PeATG1 表达变化量如图3所示。PeATG1 在22：00 表达丰度最高， 2：00 和6：00 的表达丰度次之， 再次为10：00 和18：00 的表达量， 14：00 的表达量最低。 从18：00 开始， 毛竹茎秆PeATG1 表达量显著增加， 到22：00 达到最高水平， 分别是14：00、 10：00、 18：00、 6：00 和2：00 的4.8、 3.1、 3.0、 1.3 和1.1 倍（P＜0.05）。 从10：00 到6：00，表达量总体呈先下降后上升再下降趋势。PeATG1 在夜间的表达量显著高于白天， 在2：00 及6：00 的表达量较22：00 有所下降， 但仍显著高于白天。

2.5 毛竹茎秆快速生长过程中PeATG4 基因表达模式

24 h 内毛竹茎秆PeATG4 表达变化量（图4）显示：PeATG4 在2：00 表达丰度最高， 其次为22：00、 6：00和18：00， 再次为10：00， 14：00 的表达量最低。 毛竹茎秆PeATG4 表达量从18：00 开始增加， 到2：00 达最高水平， 分别是14：00、 10：00、 18：00、 6：00 和22：00 的3.8、 2.9、 1.7、 1.6 和1.5 倍（P＜0.05）。 从10：00到6：00， 表达量呈先下降后上升再下降的趋势。PeATG4 在夜间的表达量显著高于白天， 在6：00 表达量较2：00 显著下降， 但仍显著高于白天的水平。

图3 不同时间毛竹PeATG1 定量分析Figure 3 Quantitative analysis of PeATG1 at different time

图4 不同时间毛竹PeATG4 定量分析Figure 4 Quantitative analysis of PeATG4 at different time

3 讨论

植物依靠光合作用获得生命活动所需的能量与物质。 植物在黑暗条件下， 光反应不再进行， 但仍然需要营养用以维持生命活动、 细胞的基本结构与功能［35］。 此时， 淀粉的降解便为细胞有序进行夜间活动提供了能量来源。 除了淀粉降解的经典途径外， WANG 等［15］研究发现： 植物细胞中的自噬能够在叶片淀粉降解中发挥作用。 IZUMI 等［20］发现： 自噬可以通过夜间的碳代谢提供能源替代物如游离氨基酸来提高夜间的能源供应， 有助于植物生长， 证实自噬可以在夜间为植物提供能量。 本研究通过24 h 自噬活性监测， 在22：00 和2：00 毛竹竹笋第7 节茎秆组织中观察到自噬体的存在， 而白天在相同部位未观察到，表明自噬在夜间被激活。 同时在该部位中也有淀粉粒， 表明自噬可能与淀粉的分解有关， 通过分解淀粉提供能源， 促进毛竹夜间快速生长， 这与WANG 等［15］对拟南芥自噬体定量统计的研究相一致。 在监测了24 h 自噬活性， 确认自噬在夜间被激活后， 进一步在22：00 和2：00 对第4、 7、 10 和13 节进行夜间自噬监测， 不同部位的自噬活性存在差别。 毛竹茎秆下部表面包被的笋箨已逐渐脱落， 其组织中无淀粉粒和自噬体， 该部位已完成快速生长， 发育较为成熟， 为其上部组织的生长发育提供了营养物质运输通道， 将竹篼中储存的碳水化合物向上运输至快速生长的部位， 供其代谢消耗所需； 中部正处于快速生长阶段， 自噬体的存在为分解淀粉及其他胞内物质， 从而促进该部位快速生长提供了快速供能； 而茎秆上部较幼嫩， 尚未进入快速生长阶段， 未观察到自噬体。 在毛竹笋竹茎秆尚未萌发枝叶前的快速生长期内， 茎秆的光合能力较弱， 营养物质和能量主要来源于周围的成竹［30］。 本研究结果表明： 在快速生长部位存在较多的自噬体， 可能对分解由周围成竹通过竹鞭运输至新生笋竹的碳水化合物的分解利用起到积极作用。 以上结果表明， 毛竹快速生长期， 茎秆中部较多的自噬体及其较强的分解淀粉能力可能是维持毛竹笋竹快速生长的原因之一。

自噬涉及广泛的生理过程， 其生物学意义是通过关键基因组分之间的相互作用与各种细胞途径相互作用来解释的［36］。 ATG1 是细胞自噬过程中的重要蛋白， 与ATG13 形成ATG1/ATG13 蛋白激酶复合体，响应营养物质的需求， 起始自噬小体的形成； ATG4 对ATG8 的酶切加工是ATG8 进入类泛素连接系统的前提［37］。 因此， ATG1 和ATG4 是自噬过程的关键因子之一。 到目前为止， 在模式植物拟南芥和水稻中有关ATG1 和ATG4 基因的鉴定及其在细胞自噬过程中的功能研究比较集中。 拟南芥中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ATG1 是调控自噬的关键组分ATG1/ATG13 蛋白激酶复合体的核心组分， 对自噬小体到液泡的转运十分重要。 ATG8 耦合系统是自噬体成膜过程中的一个类泛素化系统， ATG8 蛋白在细胞自噬中发挥泛素化作用的前提是其蛋白前体的C 端经半胱氨酸蛋白ATG4 剪切后， 暴露其C 末端甘氨酸残基［38］。结果表明：PeATG1 在夜间的表达加强， 显著高于白天， 诱导自噬小泡形成。PeATG4 在夜间也增强表达， 显著高于白天， 使自噬体得以形成来分解茎秆组织细胞内的淀粉， 满足毛竹茎秆进行夜间生长所需的营养供给。 在白天毛竹主要进行光合作用合成营养物质供夜间持续生长所需， 与诱导自噬小泡形成有关的PeATG1 和调控自噬体形成的PeATG4 表达水平均较低。PeATG1 和PeATG4 基因的表达水平在适应黑暗的前4 h 内均有所上升，PeATG1 表达量在22：00 达到峰值，PeATG4 在2：00 达到最高表达水平，然后在白天下降到基础水平， 这与WANG 等［15］对烟草Nicotiana tabacum夜间不同时间点ATG基因的表达变化的研究相一致。 以上结果表明： 这2 个ATG基因的转录水平在夜间显示出不同的动态变化， 这表明潜在的细胞自噬机制是活跃的。

关于毛竹茎秆快速生长相关基因的研究， 李丹丹等［29］发现： 与海藻糖合成相关的PeTPS1 在夜间表达增强， 糖信号调控关键激酶PeSnRK1 在夜间表达量先升高后降低， T6P/SnRK1 信号共同调节笋竹夜间快速生长； 祝巧鸣等［39］发现： 与糖皮质激素代谢酶相关的11β-羟类固醇脱氢酶家族基因PeHSD1 在毛竹快速生长时期表达量最低， 与毛竹快速生长负相关； 叶家其等［40］发现： 大量的赤霉素类基因参与到毛竹的快速生长过程， 且对赤霉素关键基因进行表达分析， 发现GA20ox、GA3ox和GA2ox以及赤霉素受体GID1 和正调控基因GID2 都在竹笋的形态学上部有大量表达。 本研究中对PeATG1 及PeATG4 进行定量分析发现， 两者在总体上趋势一致， 均在夜间毛竹快速生长阶段增强表达， 白天恢复至基础水平， 表明PeATG1 和PeATG4 共同协调参与自噬过程， 进而调节毛竹茎秆快速生长。PeATG1 与PeATG4 在达到表达最高峰的时间点有所不同，PeATG1 在22：00 达最高表达水平，PeATG4 则在2：00 表达量最高，可能是由于它们在诱导自噬发生、 调控自噬体形成过程中发挥的作用不同。

综上所述， 处于快速生长阶段的毛竹茎秆内存在较高活性的自噬体和PeATG1 的PeATG4 基因表达量， 这为此时期茎秆中存在细胞自噬提供了有力证据。 自噬活性和PeATG1、PeATG4 的表达量随时间由白天到黑夜呈现规律性变化， 表明毛竹茎秆不同时间段的生长发育存在明显差异， 白天生长相对缓慢， 夜间生长迅速； 且不同节间的自噬活性也不相同， 表明毛竹茎秆不同节间的生长发育也存在明显差异， 茎秆中部节间生长较快， 下、 上部节间生长相对缓慢； 茎秆中具有细胞自噬途径， 参与调节茎秆的快速生长过程。 研究成果对明确毛竹速生生长机制具有参考价值。