牟兰兰，高璐，朱蓉，赵逵

全球每年确诊的结直肠癌（CRC）新发病例超过100 万例［1］，CRC 是癌症相关死亡的第四大原因，每年造成约70万人死亡［2］。肿瘤干细胞（CSCs）理论的提出为CRC 的防治带来新的希望，结直肠癌干细胞（CCSC）的存在是CRC 手术及放化疗失败的根本原因，针对CSCs 的靶向治疗是近年研究的重点。但研究显示，选择性消融CRC G-蛋白偶联受体5阳性（Lgr5+）干细胞会引起其他已分化肿瘤细胞的代偿增殖，去分化恢复干性表型，进而恢复Lgr5+干细胞池，驱动肿瘤的再次生长［3-4］。上述研究提示了癌症干性状态的可塑性，而已分化细胞去分化恢复干性表型受其周围微环境的严格调控，且靶向肿瘤微环境（TME）能起到“一石二鸟”的作用。因此，更好地理解TME 与CCSC 干性之间的关系及相关分子调控机制，对靶向CCSC 治疗至关重要。为此，本文就TME 与CRC 干性调节相互作用机制的最新研究进展进行综述，以期为CRC 的靶向治疗提供新的策略，即在靶向CCSC 及其TME的同时，防止已分化肿瘤细胞去分化恢复干性表型。

1 CCSC 理论

CSCs 的概念在白血病的研究中被首次提出，随后在多种实体肿瘤中证实CSCs 的存在［5-7］。CCSC 理论认为：在CRC中有且只有一小部分肿瘤细胞即干细胞才是驱动肿瘤起始、增殖、转移的罪魁祸首，该理论的提出为CRC 的防治开辟了新方向。研究发现CCSC 的起源可能有以下3 种方式：正常结直肠干细胞恶变、普通肿瘤细胞去分化、微环境影响下的细胞恶性转化［8］。自CCSC 理论问世以来，如何鉴定CSCs 及相关信号调节通路一直是研究的焦点，而目前已知的CRC 干性标志物有CD166、CD133、CD44、性别决定区Y 框蛋白2（SOX2）、八聚体结合转录因子4（Oct4）、碱性/螺旋-环-螺旋转录因子（Ascl2）、G-蛋白偶联受体5（Lgr5）和乙酸脱氢酶（ALDH）等。

研究发现靶向CSCs 标志物Lgr5 引起的肿瘤消退只是暂时的，在TME 的作用下，已分化的肿瘤细胞去分化恢复其干性表型［4］。同时有学者研究发现，小鼠小肠的急性炎症伴随着Lgr5+干细胞的大量丢失，导致潘氏细胞（Paneth 细胞）重新进入细胞周期，失去其分泌功能，并获得类似干细胞的特性，从而促进组织对炎症的再生反应，其机制可能与炎症时分泌的各种细胞因子通过干细胞因子受体（c-Kit 受体）触发下游级联信号，并最终导致Paneth 细胞Wnt 信号通路激活有关；因此其提出肠道上皮对炎性反应的可塑性远远超出了干细胞和祖细胞，其可塑性甚至延伸到完全分化和有丝分裂后的Paneth 细胞；Paneth 细胞还可作为一组静止的干细胞在组织损伤时被重新激活，促进组织再生［9-10］。这使得针对CSCs的靶向治疗变得更加困难，但这些发现均为癌症的治疗带来了新的挑战与机遇。以上研究指出在肿瘤干性状态维持与转换过程中TME 发挥重要作用，但肿瘤组织中是否存在单独的细胞作为干细胞的补偿细胞以及哪些细胞能够去分化成为CSCs，还有待进一步研究［9-10］。

2 TME 与CRC 干性调节

TME 的主要成分包括血管细胞、间充质干细胞（MSCs）、肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）、免疫细胞、炎性细胞、细胞外基质等［11-13］。CSCs 生态位也是TME 的一部分，原发性肿瘤的CSCs 状态严重依赖于TME，并可能依赖于其内部的CSCs 龛位［10，14］。一方面，肿瘤细胞基因的突变在一定程度上决定了肿瘤的发生及恶性程度，另一方面其还取决于特定TME 赋予这种突变的适应度优势，即特定的TME 有利于某一种突变细胞的存活。即使在同一病灶中，肿瘤也存在着异型性。肿瘤细胞通过分泌多种细胞因子，促进成纤维细胞的募集、免疫细胞的迁移、基质的重塑以及血管网络的形成，最终形成支持肿瘤细胞生长的微环境。在TME 中，各细胞成分以不同方式影响肿瘤干性状态的维持，同时TME 的免疫耐受状态也有利于肿瘤细胞生长及逃避机体免疫系统攻击，这些均提示TME 在肿瘤发生、发展过程中扮演着重要角色，针对其的靶向治疗或将起到事半功倍的成效，这也是未来研究的热门方向。

2.1 MSCs 与CRC 的关系 MSCs 是一种具有多种分化潜能的成体干细胞，对包括CRC 在内的多种肿瘤具有天然的趋向性，其被肿瘤细胞分泌的多种趋化因子募集、迁移至CRC 肿瘤间质，参与TME 的构成，而被募集至TME 中的MSCs 在不同肿瘤和肿瘤的不同阶段功能也有所差异［15-16］。MSCs 可通过调节免疫监视、促进血管生成、启动上皮间充质转化（EMT）等途径促进肿瘤的发生发展［17］。

近年研究发现MSCs 在CRC 的发生、干性维持［18］、血管生成［19］、免疫耐受［20］中扮演重要角色［21］。MSCs 与CRC 细胞共培养可增加后者的体外成球能力，来源于人类骨髓的MSCs 能够促进结肠癌的生长与转移［22-23］。一方面，MSCs 通过外泌体分泌细胞因子和生长因子如白介素（IL）-6、 转化生长因子（TGF）-β、血管内皮生长因子（VEGF）等直接促进肿瘤发展［24］。研究发现，MSCs 促进人结肠癌细胞HT-29 免疫缺陷小鼠的体内成瘤能力，其分子机制可能与其分泌IL-6 有关，IL-6 通过转录激活蛋白3（STAT3）信号通路增加CRC 启动细胞的数量，并诱导非肿瘤干细胞表达干细胞的标志物，增加体内成瘤的能力［18］。BARTOLOMÉ 等［25］报道，激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（PI3K/AKT）信号通路可促进结肠癌转移。研究发现MSCs分泌的IL-6 可激活多种信号通路，包括蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子与激活子3（JAK2/STAT3）、细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）、PI3K/AKT 信号通路，增强MSCs 对肿瘤细胞的募集和血管生成能力［26-27］。另一方面，研究发现至少20%的CAFs 来自骨髓MSCs，表达成纤维细胞活化蛋白（FAP）的CAFs 参与了大肠癌的侵袭［28-30］。MSCs衍生的CAFs 表达IL-6、Wnt5a 和骨形态发生蛋白（BMP）4 等，可促进肿瘤的生长［31］。MSCs 的肿瘤归巢能力使其成为潜在的治疗靶点，特别是针对远处转移的CRC，利用MSCs 的归巢特性能真正靶向攻击转移灶［32］。发展基于MSCs 的靶向治疗手段，需要更加深入地了解MSCs 与CRC 细胞的相互关系。

2.2 CAFs 与CRC 干性调节 CAFs 即激活的成纤维细胞、肌成纤维细胞。CAFs 在癌症发生发展过程中发挥重要作用，其不仅提供肿瘤细胞机械支持，还控制其增殖和存活、血管生成、转移、免疫耐受和对治疗耐药性的产生。

CAFs 以多种方式促进CRC 的发生发展：（1）CAFs 通过分泌多种可溶性因子，如趋化因子配体12（CXCL12）、趋化因子配体7（CCL7）、TGF-β、HGF 等，与肿瘤细胞相互作用，促进肿瘤发展［33］。TGF-β 通过TGF-β/Smad 信号通路诱发肿瘤细胞的EMT［34-35］。（2）CAFs 参与CRC 干性维持，从而介导肿瘤耐药，靶向CAFs 可显著降低化疗的耐药性。一方面，CAFs 通过介导BMP 拮抗剂分泌受限，维持BMP 在隐窝基底部的低活性，参与CRC 干性维持［36］；另一方面，CAFs 通过分泌生长因子及外泌体来直接促进肿瘤干性维持。CAFs 细胞分泌因子可促进已分化的肿瘤细胞恢复其干性表型［37］。研究表明，CAFs 介导CRC 耐药的机制可能与其分泌外泌体有关，CAFs 来源的培养基可促进CRC 细胞的体外成球及致瘤能力，同时纯化的外泌体也可促进CSCs 的成球和致瘤能力，抑制外泌体的释放可以有效阻止上述效应，更主要的是阻断外泌体还可减少CSCs 的数量；该研究结果还发现，在CRC 中，两种潜在的机制可能协同作用并导致CSCs 耐药，一是CSCs 对化疗具有固有的耐药性，另一个原因是CAFs 分泌外泌体，而后者是诱导CSCs 产生耐药性的主要原因［38］。研究表明，CAFs 分泌含有lncRNA H19 的外泌体，其可促进CRC 的发生及耐药［39］。上述两项研究均指出CAFs 可能通过分泌含有lncRNA H19 的外泌体激活Wnt 信号通路从而参与CRC 干性维持与耐药产生。关于CAFs 介导肿瘤耐药的机制，IZUMI等［40］的研究发现，T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（TIAM1）在多种肿瘤中高表达，特别在化疗药物无效的CRC 中过度表达，该团队首次提出TIAM1 是Wnt 信号通路相关基因之一，在CRC 中被CAFs 上调，增强CRC 的耐药性及干性表型。（3）CAFs 能够通过重塑TME 来调节肿瘤免疫［41］，也可通过招募免疫抑制细胞如调节性T 细胞（Tregs）促进TME 免疫耐受，从而形成更适应肿瘤生长的微环境［35，42］。（4）CAFs产生基质金属蛋白酶（MMPs）致使细胞外基质（ECM）降解及重构，ECM 的重构作为肿瘤转移的早期步骤，协助肿瘤细胞的远处定植和生长，进而促进肿瘤细胞的远处转移［43］。同时CAFs 还产生广泛的ECM 成分和蛋白水解酶，调节结缔组织的构成，通过在ECM 中形成隧道促进肿瘤细胞远处转移［44］。关于CAFs 与肿瘤的相互关系一直是研究的热点，来自CAFs的外泌体甚至在使用化疗药前即可通过启动CSCs 促进耐药，这也为治疗提供了一个新的策略，即在化疗前阻断CAFs 的分泌，以获得更好的临床效益［38］。

2.3 TME 免疫耐受特点及机制 TME 特点之一即免疫耐受，肿瘤可诱导免疫耐受来逃避机体免疫系统的攻击。来源于骨髓的免疫细胞释放化学因子和细胞因子，进而形成有利于肿瘤细胞生长和侵袭的微环境［45］。肿瘤细胞可能通过抗原变异、抗原提呈细胞失调、物理屏障的形成、招募免疫抑制细胞等方式介导免疫耐受形成，从而逃避机体免疫系统攻击。TME免疫耐受形成的主要机制如下：（1）肿瘤浸润性T 淋巴细胞免疫抑制性检查点分子的上调。免疫抑制性检查点分子的主要功能是防止免疫系统攻击机体自身成分，预防自身免疫。研究发现肿瘤浸润性T 淋巴细胞高表达免疫抑制性检查点分子，如程序性死亡受体1（PD-1）、细胞毒性T 淋巴细胞抗原4（CTLA-4）、淋巴细胞激活基因3（LAG-3）等［46］。同时细胞程序性死亡-配体1（PD-L1）在肿瘤细胞的表达上调，PD-L1 与T 淋巴细胞上的免疫抑制检查点分子PD-1 结合后抑制T 淋巴细胞的活化和存活，肿瘤细胞通过这种方式逃避机体免疫系统攻击。针对免疫抑制性检查点的靶向治疗（即使机体免疫系统能够识别肿瘤细胞）是当前研究热点，研究发现使用抗体干扰PD-L1 与PD-1 的相互作用，可增强T 淋巴细胞介导的杀伤肿瘤细胞的能力［47-49］。（2）许多细胞参与抗肿瘤反应，但肿瘤浸润细胞毒性T 淋巴细胞占主导地位，研究发现CAFs 可降低细胞毒性T 淋巴细胞活性，进一步研究发现CAFs 通过PD-L2 和人凋亡相关因子配体（FASL）参与诱导T 淋巴细胞死亡，CAFs 利用肿瘤抗原交叉递呈和关键免疫检查点配体的协同上调，介导抗原特异性T 淋巴细胞死亡和细胞毒性T 淋巴细胞功能受损，从而促进免疫耐受形成［50］。（3）被募集至TME 中的免疫抑制细胞也参与TME免疫耐受的形成。免疫抑制细胞如Tregs、骨髓源性抑制细胞（MDSC）在肿瘤免疫耐受的形成中扮演重要角色。研究发现大肠癌中隐藏着一种关键免疫抑制细胞（γδT17 细胞）［51］，而γδT17 细胞是IL-17 的主要细胞来源；越来越多的证据表明慢性炎症和癌症密切相关，持续存在的炎性细胞和细胞因子可能将炎症微环境转化为免疫抑制环境，从而进一步促进肿瘤进展［52］。研究发现IL-17 是一种肿瘤促进细胞因子，γδT17 细胞不仅产生大量的IL-17，还分泌IL-8、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等，这些信号将进一步促进MDSC 的迁移、存活，从而介导肿瘤免疫耐受。

3 TME 与CCSC 干性状态调节

CSCs 与TME 关系密切且相互作用，破坏这一生态位微环境会损害CSCs 的自我更新，从而显著抑制肿瘤的生长。一些肿瘤细胞需要与基质细胞共注射才能形成肿瘤，表明CSCs受周围微环境因子的支持［53］。SHIMOKAWA 等［4］通过基因插入失活CSCs Lgr5 基因，观察到肿瘤消退，但另一部分肿瘤细胞去分化形成“新”CSCs，新的Lgr5+CSCs 迅速出现，并且肿瘤反弹，提示杀死CSCs 将释放生态位并允许分化的肿瘤细胞填补空间成为CSCs。DE SOUSA E MELO 等［3］发现，选择性消融小鼠CRC Lgr5+CSCs 可抑制原发肿瘤的生长，但不会导致肿瘤消退，此时肿瘤是由Lgr5-细胞来维持，并且Lgr5-细胞不断地补充Lgr5+CSCs 干细胞池，导致治疗停止后肿瘤迅速重新开始生长；同时该团队也发现Lgr5+CSCs 对于CRC 肝转移瘤的形成和维持至关重要，与原发部位相反，在肝转移瘤中，肿瘤细胞的增殖更依赖于先前存在的Lgr5+CSCs，并且不具有诱导新发CSCs 的能力；对于转移部位Lgr5-细胞未发生去分化的原因，一种解释是可能不存在必需的干细胞龛。上述研究均提示CCSC 干性状态是一个动态过程，并受TME 提供的各种信号蛋白调节。

参与调节直肠癌干性的信号通路主要有Wnt/β-catenin、Notch、BMP、Hedgehog 信号通路。正常肠隐窝干细胞增殖、分化的维持需要上述信号通路的相互调节，共同维持并精确调控TME 来控制CSCs 的增殖与分化。在CRC TME 中，Wnt、Notch、BMP、Hedgehog 信号呈浓度梯度分布，Notch 和Wnt 信号水平在隐窝基底部最高，从隐窝底部向上至分化室，信号水平逐渐降低。然而，BMP 和Hedgehog 信号传导在隐窝的分化区室中较高。也就是说，结直肠隐窝细胞所处浓度梯度中的位置决定了其表型［36，54］。因此了解CSCs 及其生态位之间的相互作用可能是癌症治疗的一个范式转变。

3.1 Wnt 信号通路 大量证据表明，Wnt 信号通路参与正常肠道干性与CRC 干性的维持，并发挥重要作用，约90%的CRC 患者存在Wnt 信号通路的改变［55］。Wnt 信号通路与CRC 耐药相关［56］，该信号通路成为导致CAFs［57］激活的主要信号通路，促进肿瘤耐药［38，58］。研究发现，小肠肠道干细胞附近的Paneth 细胞是Wnt3a 的主要来源之一，且维持了隐窝基底部Wnt 信号的高浓度，因此在空间上限制了干细胞的分布，即位于隐窝基底部；删除Paneth 细胞可以减少干细胞的数量，而Paneth 细胞表达表皮生长因子（EGF）、TGF-α、Wnt3 和Notch 配体Dll4，以上成分对体外CSCs 培养至关重要［59］。与小肠组织不同，结直肠隐窝中无Paneth细胞，因此结直肠Wnt 蛋白的来源仍然是一个有争议的问题，但研究发现CRC 基质成纤维细胞可能是Wnt 蛋白的主要来源［57，60-61］。在肠隐窝Wnt 蛋白的分布是不均匀的，隐窝基底分布着高水平的Wnt 蛋白［36］。在CRC 中，基质肌成纤维细胞附近Wnt 信号活性较高。有研究发现位于CRC TME 中的成纤维细胞分泌Wnt 因子与调节邻近上皮细胞生长和分化有关［55］，如肝细胞生长因子（HGF）、骨桥蛋白（OPN）和基质衍生因子1（SDF1）等。CAFs 分泌蛋白可能通过增强Wnt信号通路活性，从而参与肿瘤干性调节［36-37，62-63］。以上研究提示CRC TME 成纤维细胞可能是CRC Wnt 蛋白的来源，对于维持隐窝基底高Wnt 水平至关重要。Wnt 信号通路的激活将进一步促进下游靶基因c-Myc、CCND1、CCND2、Axin2、Sox4、TCF7、Ascl2 和Lgr5 等的表达，这对CSCs 干性表型的维持至关重要。

3.2 BMP 信号通路 BMP 主要由基质细胞分泌，其主要作用是拮抗肠隐窝Wnt 信号，从而阻止CSCs 增殖和推动CSCs 分化。BMP 在平衡Wnt 信号通路驱动的肠上皮自我更新和增殖中起关键作用。研究显示，BMP 信号已被证明对Lgr5+肠道干细胞的自我更新具有负调控作用，可抑制CRC 的形成［64］。研究发现BMP 与拮抗剂Gremlin1、Gremlin2、Noggin 结合而被抑制，在结直肠隐窝底部Noggin 特异性结合BMP，从而阻止受体相互作用［10］。此外，CSCs 的培养需要加入BMP 抑制剂Noggin。研究显示，BMP4 诱导CCSC 分化，经BMP4 处理的CSCs 在免疫缺陷小鼠体内致瘤能力下降［65］。有研究发现在肠道隐窝中BMP 在隐窝基底部表达较低，在隐窝顶部较活跃，从而阻止CSCs 增殖，促进CSCs 分化［36，65-66］。DAVIS 等［36］在遗传性混合息肉病综合征（HMPS）组织和HMPS 小鼠模型中发现编码BMP 拮抗剂Gremlin1 的基因异常，高表达的Gremlin1 破坏了体内的BMP 梯度，拮抗隐窝顶部的BMP 活性，从而促进了已分化的Lgr5-细胞去分化恢复其干细胞特性。上述研究表明，在正常肠隐窝近管腔侧BMP 信号较高，BMP 通过拮抗Wnt 信号从而促进CSCs 分化；在隐窝基底部则相反，BMP 信号较低，且与拮抗剂结合而被抑制，导致隐窝基底部高Wnt 信号活性，进而阻止CSCs 分化，维持CSCs 干性状态。Hedgehog 已被证明可能通过BMP 抵消Wnt 信号驱动的上皮细胞增殖［62］。研究表明他汀类药物可能通过激活CRC 细胞的BMP 信号通路抑制肿瘤生长［62］。这为CRC 的靶向治疗提供了理论依据，但其具体机制还需进一步研究。

3.3 Notch 信号通路 Notch 信号通路主要通过细胞与细胞之间的相互接触来维持组织分化发育。和Wnt 信号在肠隐窝的分布类似，Notch 信号在肠隐窝底部（基底侧）最高，在肠隐窝顶部（管腔侧）最低，Notch 与Wnt 协同作用促进CSCs 增殖、抑制CSCs 分化，在CCSC 干性的维持中起重要作用。当Notch 信号通路被激活时，Notch 受体经金属蛋白酶（ADAM）和γ-分泌酶（GS）催化酶切后，释放Notch 胞内结构域（NICD），NICD 易位至细胞核，与转录因子CSL 结合，形成NICD/CSL 转录激活复合体，进而激活下游靶基因的转录。抑制Notch 信号通路活性，可减少CRC 的生长、转移［67］。内皮细胞（EC）也可能是肠道肿瘤生态位的组成部分，肿瘤中EC 产生的可溶性Notch 配体可诱导结肠CSCs 的干性，是一个潜在的治疗靶点。

4 CRC 靶向治疗

常规放化疗不能消灭CCSC，使其成为肿瘤复发转移的根源，只有消灭CSCs，才有可能治愈肿瘤。因此，需要制定新的、特定的靶向治疗与传统疗法相结合的新策略，以消除所有肿瘤细胞，这也是肿瘤靶向治疗的研究热点。但CSCs 是受TME调控而动态变化的，这使得针对CSCs 的靶向治疗遇到瓶颈，也是当前研究迫切需要解决的问题。

事前通知，要求即将参加微格教学的学生通过理论、音像教材预习要学习的临床操作技能，提高学生对基本操作步骤的认识和熟悉度。

CSCs 表面分子标志物及其相关信号通路调节一直是研究的热门话题。CCSC 表面标志物及信号通路蛋白是靶向CSCs的良好生物学标志。选择性环氧合酶-2（COX-2）抑制剂被证明是一种潜在针对CSCs 的靶向治疗药物［68］。近年来，大量的流行病学和实验研究表明，非甾体抗炎药（NSAIDs）可以抑制甚至逆转CRC 癌前病变［69-70］。阿司匹林、塞来昔布等是目前公认的能有效预防、治疗结肠癌的药物，其能明显减少结肠腺瘤性息肉等的发生，缩小甚至消退已有腺瘤性息肉，从而降低结肠癌的发病率［71］。研究发现，阿司匹林可抑制CRC 细胞Lgr5 的表达［72］，其与姜黄素联合应用可减少大鼠CRC 干性指标的表达［73］。上述研究指出，阿司匹林、塞来昔布等NSAIDs 的抗肿瘤作用与抑制CCSC 相关［74］。

靶向肿瘤表面分子的治疗同时也面临着一些问题，如肿瘤干性标志物通常也是正常干细胞的标志物。另一方面，TME可促进已分化肿瘤细胞去分化恢复干性状态，哪些因素会推动细胞去分化以及哪些肿瘤细胞具有去分化能力还有待确定，但证据确凿的是干性是一种动态状态［75］。研究发现TME 促进肿瘤化疗耐药的产生［76］，TME 通过减少药物扩散以及分泌细胞因子、趋化因子和生长因子来减轻化疗药物的细胞毒性［77-78］。同时针对TME 的靶向治疗如靶向VEGF 的抗血管生成疗法（如贝伐珠单克隆抗体）可有效抑制CSCs［79］。在靶向抑制肿瘤细胞的同时，联合靶向抑制TME（如肿瘤相关巨噬细胞、CAFs）的治疗方法在体内、体外研究中均已获得成功［80］。TME 参与肿瘤干性调节，保护肿瘤细胞免受免疫系统攻击，介导化疗耐药。因此，化疗药物与抗TME 相关药物的联合应用将取得事半功倍的疗效。

5 小结与展望

CRC 治疗的关键是消灭CSCs，这就要求在消灭已有CSCs 的同时，必须阻断已分化细胞的再次去分化，而后者才是治疗的关键，也是CSCs 理论迫切需要解决的问题。TME 各细胞成分通过分泌细胞因子、生长因子等参与肿瘤干性的调节、化疗耐药及免疫耐受的产生。新的肿瘤靶向治疗理念——针对CSCs 及其细胞外支持物的多管齐下的方法将产生事半功倍的效应，也是肿瘤靶向治疗研究的热点。进一步探索TME参与CCSC 干性调节的分子机制，为联合TME 及CSCs 的靶向治疗方法提供理论依据。

作者贡献：牟兰兰进行文章的构思与设计，文章的可行性分析，文献/资料收集、整理，撰写论文；高璐进行文献收集；朱蓉进行论文、英文的修订；赵逵进行文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。