王晓静，李潞滨，王 涛

（1.林木遗传育种国家重点实验室，中国林业科学研究院林业研究所，北京100091；2.北京市植物园，北京市花卉园艺工程技术研究中心，城乡生态环境北京实验室，北京100093）

植物内生菌是指其一生或至少一生中的某个阶段能进入活体植物组织内，并不引起明显组织变化的微生物群，可分为内生真菌、内生细菌和内生放线菌等［1］。此外，植物内生菌目前没有严格的定义和界限，在生活史中某一阶段能营造表生生活的表生菌、对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根菌等也被认为属于内生菌的范畴［1－3］。近年来，植物内生菌逐渐受到人们的关注。研究表明，内生菌存在于几乎所有类群的植物中，并且可以参与宿主的生理活动，影响宿主植物的激素合成与代谢、固氮、抗逆、抗病等［4－7］；同时内生菌能够产生与宿主植物相同或相似的活性物质，对药物开发具有潜在的重要价值［8］。

竹类植物是禾本科竹亚科植物的总称，具有重要的生态、经济和文化价值。全世界共有竹类植物70多属1 200多种，主要分布在热带和亚热带地区，少数分布在温带和寒带［9］。中国是竹类植物的自然分布中心之一，有39属500余种竹子，竹林总面积约440万hm2，约占森林面积的2.94%；同时中国是世界上竹产业最发达的国家之一，竹产品贸易量居世界前列［10］。丰富的竹类资源以及分布地环境气候的多样性使竹林生态系统蕴含着大量的微生物资源，如何利用这些微生物资源一直是相关研究的关注点。研究竹类植物内生菌可以挖掘与竹子促生、抗病相关的有益内生菌，促进内生菌活性物质开发，对竹林培育、竹林生态系统维护和竹产业的发展具有重要意义。

1 竹类植物内生菌分布

竹类内生菌在宿主体内分布广泛，在竹根、竹鞭、杆、叶、枝、笋、种子等器官中均检测到大量内生菌。土壤是植物内生菌的重要来源，袁宗胜发现毛竹（Ph.edulis）竹鞭中细菌群落结构与毛竹根区土壤样本接近，与竹笋、竹杆中内生细菌群落差异较大。竹笋中内生菌种类数量随着成长逐步增多，且发笋期与毛竹竹杆组织及根区土壤细菌群落结构均有较大差异。叶片长期暴露在空气中，容易被病原菌入侵，撑×绿杂交竹（Bambusa pervariabilis×Dendrocalamopsis daii）的病叶年平均内生细菌数量和平均物种丰富度大于健康叶［11］；叶片的营养、水分、年龄、形态特征等也会影响内生菌的分布，青竿竹（B.tuldoides）老叶的内生真菌数量比嫩叶高，且不同年龄叶片的优势菌属也存在差异。但青竿竹叶片主脉中分布的内生真菌比次脉少，可能是由于这些内生菌的来源是空气而不是沿着叶脉有系统的分布［12］。与其他器官相比，竹种子的内生菌研究较少，对竹种子内生细菌和内生放线菌的研究未见报道。种子内生菌可随着萌发等过程出现在子叶等部位中，并可以从亲本垂直传播到后代［13－14］。Shen等［15－16］在毛竹种子中分离到至少11个属的350株内生真菌，这些菌属在毛竹枝中也被发现。但由于毛竹营养繁殖时间长达100 a之久，限制了对其种子垂直传播的进一步研究。

2 竹类植物内生菌多样性

2.1 竹类内生真菌多样性

研究者对毛竹、撑×绿杂交竹、小蓬竹（D.luodianense）、水竹（Ph.heteroclada）、青竿竹等竹种的内生真菌进行了探究，已分离的竹类植物内生真菌大部分属于子囊菌门（Ascomycota），包括节菱孢属（Arthrinium）、镰刀菌属（Fusarium）、炭角菌属（Xylaria）等，少量属于担子菌门（Basidiomycota）。

Umali等［12］从青竿竹叶片中共分离到2 484株内生真菌，发现镰刀菌（F.solani）和无孢菌类（Myceliasterilia）在嫩叶中大量富集，而老叶中富集最多的真菌是无孢菌类、Arthrinium alternata、Xylariaceousspp.和Sporormiella minima等。Morakotkarn等［17］从23株日本刚竹属（Phyllostachys）和赤竹属（Sasa）竹种的叶片、节和节间分离获得257株内生真菌，对其中71株代表性菌株进行鉴定，结果均属于子囊菌门粪壳菌纲（Sordariomycetes）和座囊菌纲（Dothideomycetes），其中炭角菌目（Xylariales）是主要的内生真菌类型，尤其是节菱孢属。Shen等［15－16］分别从毛竹枝和种子中分离到至少20个属的内生真菌，大部分分布在粪壳菌纲和座囊菌纲。毛毳从撑×绿杂交竹的叶片中分离到28种内生真菌，其中在健康叶中分离鉴定到16种，在病叶中分离鉴定到20种，Aspergillusspp.和Microdochium phragmiti在健、病叶片中都处于优势地位［11］。白燕［18］从毛竹、慈竹（Neosinocalamus affinis）、撑×绿杂交竹、硬头黄竹（B.rigida）、梁山慈（Dendrocalamus farinosus）、西凤竹（B.multiplex）6种竹子叶片中分离得到节菱孢属、拟盘多毛孢菌属（Pestalotiopsisspp.）、竹黄菌属（Shiraiaspp.）、格孢腔菌属（Pleosporalesspp.）等菌种。颜强［19］从小蓬竹的根、茎、叶中共分离出103株内生真菌，属于19属，节菱孢属、镰刀菌属、木霉属（Trichoderma）、炭角菌属为优势菌属。根中镰刀菌属与漆斑菌属（Myrothecium）分离率最高；茎中以拟茎点霉属（Phomopsis）、弯孢聚壳属（Eutypella）等为优势菌属；叶片中节菱孢霉属为优势菌属。Zhou等［20］从水竹的枝和叶中分离出127株内生真菌，至少属于14个属，其中Calcarisporium、Preussia、Creosphaeria和Phialophora4个属的内生真菌为首次在竹类植物中被分离到。此外，徐曦使用DEEG-PCR方法在毛竹竹鞭中检测到与小脆柄菇属（Psathyrella）、二叉韧革菌属（Dichostereum）等序列相似度较高的条带，在竹根中发现与小不整球壳属（Plectosphaerella）等序列相似度较高的条带，同时发现竹鞭和竹根内生菌群对基腐病呈现非线性响应，但绝对优势菌群未发生变化［21］。

竹类植物内生真菌中发现的一些属在竹子或其他植物中被记录为病原菌，如链格孢属（Alternaria）、小球腔菌属（Leptosphaeria）、镰刀菌属、赤霉菌属（Gibberella）和炭疽病菌属（Glomerella）等，但在相应植物材料中没有发现症状，研究者推测这些真菌在其生命周期的某些阶段可能是潜在的病原体或内生菌［16－17］。

2.2 竹类内生细菌多样性

目前研究者已经对毛竹、撑×绿杂交竹、雷竹（Ph.praecox）等竹种的内生细菌多样性进行了研究。韩烁［22］在毛竹野生株和航天诱变株根部分别分离到66株和60株内生细菌，分属6大类群15属和5大类群8属。在野生株和诱变株中共同存在α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）等5大类群，优势类群均为α-变形菌纲，最优势种群为根瘤菌属（Rhizobium）。使用焦磷酸测序检测毛竹竹鞭、竹笋、杆3个部位的内生细菌中，变形菌门（Proteobacteria）占主要地位，肠杆菌目（Enterobacteriales）广泛存在各组织中［23］。刘芳等［24］从毛竹根、鞭、杆和叶中分离获得27株内生细菌，分别属于14属18种，其中根部以芽孢杆菌属（Bacillus）为主要菌群；鞭部以节细菌属（Arthrobacter）为主要菌群；杆部以葡萄球菌属（Staphylococcus）和苍白杆菌属（Ochrobactrum）为主要菌群。夏冬亮等［25］从毛竹根中分离出40株内生细菌，分属9属16种，其中67.5%的内生细菌属于变形菌门，伯克氏菌属（Burkholderia）、假单胞菌属（Pseudomonus）和短小芽孢杆菌（Lysinibacillus）为主要菌属［26］。袁宗胜［27］从福建省武夷山、将乐、长汀3个采样地的毛竹竹鞭中分离到34株内生细菌，初步鉴定分属于14属20种，其中武夷山样品内生细菌以节细菌属为优势菌群；将乐样品以芽孢杆菌属和短小杆菌属（Curtobacterium）为优势菌群；而长汀样品以产碱杆菌属（Alcaligenes）和葡萄球菌属等为优势菌群，初步显示了毛竹内生细菌的群落多样性特征和不同环境条件对竹类植物内生细菌多样性的影响。Zhang等［28］在雷竹林根系中鉴定到分属于6大菌门的4516个OTUs，与毛竹根系结果一致，雷竹根系中变形菌门为主要菌门。侯伟等［29］从刺竹（B.blumeana）的根、茎和叶中共分离得到40株内生固氮细菌，主要分布在根部，经鉴定属于固氮螺菌属（Azospirillus）、水螺菌属（Aquaspirillum）、大肠杆菌（Escherichia）和假单胞菌（Pseudomonas）。此外，白燕对四川毛竹、慈竹、撑×绿杂交竹、硬头黄竹、梁山慈、西凤竹6个竹种的叶片内生细菌多样性进行了比较和分析，并分离得到芽孢杆菌和假单胞菌等菌种。毛毳发现芽孢杆菌是撑×绿杂交竹健康叶片中内生细菌的重要部分，并在健康叶和病叶中分离得到鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriumspp.）、寡养单胞菌（Stenotrophomonasspp.）等内生细菌［11］。

2.3 竹类内生放线菌多样性

放线菌是具有分枝状菌丝体的革兰氏阳性菌，细胞结构和细菌基本相同，因其强大的次级代谢产物编码能力而备受关注。植物内生放线菌生长缓慢、分离困难而研究相对较少。链霉菌属（Streptomyces）是植物内生放线菌中较大的类群，毛毳［11］在撑×绿杂交竹叶片中鉴定出3种链霉菌。张丽娜［30］从撑×绿杂交竹的根、茎和叶中分离出54株内生放线菌，根内种类明显多于叶片和茎；其中2株属于小单孢菌（Micronnospora），3株属于诺卡氏菌（Nocardia），其余49株均属于链霉菌，并分为球孢类群（Globisporus）、灰褐类群（Griseofuscus）等5个类群。白燕在撑×绿杂交竹和慈竹叶片中分离到微杆菌（Microbacteriumspp.）和链霉菌，在硬头黄竹中分离到微杆菌。此外，研究者在竹类植物内生细菌研究中也分离和鉴定出少量的内生放线菌［18］。雷竹根部内生细菌多样性检测发现，9.48%序列属于放线菌门（Actinobacteria）［28］。毛竹竹鞭、竹笋、杆3个部位也均检测到放线菌门内生菌［23］。夏冬亮［31］使用8种培养基对毛竹根部内生细菌进行分离时，分离所得优势菌为枝动菌属（Mycoplana）和赖氏菌属（Leifsonia），均属于放线菌。韩烁［32］在毛竹野生株和航天诱变株根部共分离到4株放线菌，分别属于微杆菌属、拉贝达氏菌（Labedella）鞘氨醇菌属（Chitinophaga）和赖氏菌属，并与前人分离出同一种赖氏菌L.poae［32］。

3 竹类植物内生菌生物学作用

内生菌与宿主植物长期互作，形成了复杂的关系，宿主植物为内生菌的生长提供了合适的环境和营养，内生菌反之通过代谢或信号传导影响植物生长。植物内生菌可以促进宿主的生长，增加宿主植物的抗性，并能促进植物次生代谢物的产生。对竹类植物内生菌生物学作用的研究，主要包括促生作用、抗病作用、医药等其他方面。

3.1 促生作用

内生菌与植物互作关系的一个重要体现就是能够促进宿主的生长，内生真菌、内生细菌和内生放线菌能通过产生植物激素、对土壤中营养元素的溶解、固氮作用等不同方式促进植物的生长。

竹类植物内生菌的促生作用研究目前主要集中在竹类内生细菌。韩烁［32］从毛竹根部分离获得36株具有解磷活性的内生细菌，49株产IAA的内生细菌，35株分泌铁载体的内生细菌株。袁宗胜从毛竹中筛选出20株具有解磷解钾功能的内生细菌，主要属于产碱杆菌属，肠杆菌属（Enterobacter）和芽孢杆菌。其中属于肠杆菌、不动杆菌（Acinetobacter）和芽孢杆菌的3株菌兼具高效解磷解钾固氮功能，其复合菌液可以增加毛竹林立株数，增加毛竹叶片叶绿素含量，提高毛竹叶片的光合作用强度和光能转换速率［33－35］。杨豆等［36］从毛竹根系中分离得到2株好氧性革兰氏阴性杆菌（Burkholderia lata和Enterobacter ludwigi），具有较好的解磷和分泌IAA能力。候伟［29］从刺竹中分离得到40株内生固氮菌，包括固氮螺菌属、水螺菌属、大肠杆菌和假单胞菌，均具有较高的固氮酶活性，其中有5株菌固氮酶活性高且稳定、生长势强。此外，放线菌中弗兰克氏菌也具有与根瘤菌相似的固氮作用，但目前在竹类植物中研究较少。解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）是常用的植物促生菌，在马来甜龙竹和撑×绿杂交竹中已被报道，研究发现其对勃氏甜龙竹（D.brandisii）、缅甸龙竹（D.birmanicus）、龙竹（D.giganteus）和油簕竹（B.lapidea）的一级侧根长、径粗具有极显著的促进作用［37］。

3.2 抗病作用

中国竹类病害种类较多，尤其是竹类真菌病害，已经成为制约竹产业生产的重要因素之一。利用内生菌进行植物病害生物防治是近年来的研究热点之一，研究者已经从竹类植物中分离到大量具有病原拮抗作用的内生菌。

枯梢病是一种对竹类植物危害严重的真菌病害，杨豆等［36］从毛竹根系中分离到16株对毛竹枯梢病病原菌竹喙球菌（Ceratosphaeria phyllostachydis）具有拮抗作用的内生细菌，其中菌株PN1和PN6具有显著的抑菌活性。张丽娜［30］在撑×绿杂交竹中筛选杂交竹梢枯病病原菌的拮抗附生和内生放线菌，其中5株内生放线菌具有拮抗功能，一株分离自根内的加利福尼亚链霉菌（Streptomyces californicus）抑菌作用较好。毛壳菌是在防治植物病害方面突出的生防菌，余应健［38］从撑×绿杂交竹中分离到一株内生毛壳属真菌（Chaetomiumspp.），并对其杀毒剂毒力和病原菌拮抗能力进行了测定。周宵等［39］在从毛竹根部内生菌中筛选得到一株具有生物活性的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），对尖孢镰孢（F.oxysporum）、互隔链格孢（Alternaria alternata）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、灰葡萄孢（Botrvtis cinerea）、小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora）、柑橘青霉病菌（Penicillium italicum）等病原菌均具有抑制作用，对灰葡萄孢，小孢拟盘多毛孢和柑橘青霉病菌的抑菌效果更为明显，首次发现对拟盘多毛孢属病原菌的抑制作用。Shen等［15］从竹枝中分离得到5株内生真菌，分别属于弯孢菌属（Curvularia）、球形枝孢属（Cladosporium）、蓝藻单孢菌属（Simplicillium）、双孢菌属（Didymella）和青霉菌属（Penicillium），对至少4种病原菌具有抗性，对常见的番茄红病菌和黄瓜疫霉也有不同程度的抑制作用。毛竹种子中存在大量的内生真菌，Shen等［16］从毛竹种子中分离并筛选出5株对临床细菌和酵母菌具有广谱抑制活性的内生真菌，分别属于青霉菌、枝孢菌、弯孢菌、竹黄菌和一个未知菌株。Zhou等［20］从水竹中筛选出4株内生真菌，鉴定为齿梗孢霉（Calcarisporium arbuscula）、Preussia minima、Setophomaspp.和Perenniporiamedullapains，在病原菌拮抗实验中表现出广谱抗性，其中Setophomaspp.菌株对临床细菌和酵母菌具有较高的生物活性。此外，竹肉球内生菌（Engleromyces goetzei）多肽粗提物对小麦赤霉病菌、核果炭疽病菌、和茄子黄萎病菌能够产生抑菌活性［40］。从孝顺竹叶片分离得到的枯草芽孢杆菌（B.subtilis）对水稻白叶枯病菌和水稻条斑病菌具有较好的防治效果［41］。从苦竹（P.amarus）分离的炭角菌属内生菌，其次级代谢产物对8种作物病原菌也具有一定的抑菌效果［42］。

3.3 其他相关

植物内生菌能够产生丰富的次级代谢产物，同时在与寄主长期协同进化中还可以产生与植物次生代谢物相似的物质，并能够促进宿主活性代谢物的积累，对药物开发有重要意义［8］。苦竹是一味传统中药，能够产生黄酮类、萜类、生物碱等多种次生代谢物，研究者对苦竹内生菌的次生代谢产物进行了研究。从炭角菌属和拟茎点霉属3株苦竹内生真菌的次级代谢产物中分离出杜松烷型倍半萜类、甾体类等单体化合物，并对其毒性和化感作用进行了初步测试［42－44］。竹黄菌是子囊菌纲（Asccmycetes）肉座菌科（Hypocreaceae）竹黄属真菌，其子实体经常寄生于短穗竹（Brachystachyum densiflorum）等竹种［45］。竹黄菌还能以无症状内生真菌的形式存在于寄主中而不产生子实体，多项研究已分离出竹黄属真菌［16，46］。竹黄菌含有大量的活性物质，包括苝醌类化合物、甾醇类、多糖类等。竹红菌素是是竹黄菌的主要活性成分，是一种安全、高效、低毒的抗肿瘤药物，对心血管疾病和皮肤病等有明显的抑制作用［47］。11，11′-二去氧沃替西林也是分离自竹黄菌的天然活性物质，能够在肿瘤治疗中抑制新生血管生成、细胞G／M期阻滞［48］。研究发现，从竹黄菌寄生竹的枝、根、叶中分离出7株内生细菌和11株内生真菌，使用其多糖粗提物作为激发子能够提高竹黄菌菌丝的竹红菌素含量，其中一株栓菌属内生菌的激发效果最明显［49］。此外，通过基因编辑、高通量测序等方法对竹红菌素的生物合成基因和合成通路也进行了研究［50－51］。

4 总结与展望

几乎所有的植物中均存在内生菌，它们的次生代谢产物与活性物质生产能力、与宿主及病原菌的关系、在生态系统中作为降解者的作用等是人们关注的重点。全世界约有竹类植物70多属1 200多种，中国有39属500余种，已进行内生菌研究的竹种仅有10余种，且目前竹类植物内生菌研究主要集中在内生菌分离与鉴定、有益菌的测试和筛选等方面，大多数竹种的内生菌资源仍处于待开发状态。此外，竹类内生菌的分布及来源，以及竹类内生菌和宿主之间的专一性和多样性研究也待开展。随着三代全长测序等技术的发展，使用高通量扩增子测序等分子手段结合传统的可培养方法，将能有效促进对竹类内生菌多样性的研究。

竹类植物中内生菌与宿主植物互作机制的研究较少。有些病原菌在某些条件或某个阶段可以作为内生真菌不产生病害，在研究此类内生菌在竹类植物的定殖时，或可考虑与其致病机理相结合，全面了解其与竹类植物的互作关系。竹类植物内生菌的抗逆性研究虽部分已测定其对病原菌的抗性，但距离实际应用推广仍有一定差距。需要结合基因组学、代谢组学、基因编辑等现代生命科学方法深入研究其抗病机制，以开发稳定性高、对宿主毒性少、抗病性高的菌株或药物。此外，竹类内生菌促进宿主非生物胁迫抗性的研究较少，加强相关研究有助于全面了解竹类内生菌的生物学功能。竹类内生菌与竹林生态系统密切相关。在竹类植物中，内生菌、宿主、土壤、病原菌等共同构成了一个系统，研究竹类内生菌的来源、在宿主体内的动态变化、在竹林凋落物中的降解作用等，能够为竹类内生菌的演替过程及竹林生态系统的研究提供参考。