APP下载

鼻咽癌患者放疗后血清玻连蛋白的变化研究*

2020-01-11何奋军刘少玲张同韩郑巧仪朱玉亮孔祥波

中国医学创新 2020年35期
关键词:骨细胞鼻咽癌空白对照

何奋军 刘少玲 张同韩 郑巧仪 朱玉亮 孔祥波

放射性颌骨坏死(osteoradionecrosis of the jaws,ORNJ)是鼻咽癌放射治疗后的严重并发症,其发病率为1%~37%[1],其临床表现为颌面部软、硬组织坏死溃烂,且伴有明显的疼痛症状,给患者的健康和生活质量带来严重危害[1-3]。目前,对这种并发症的治疗不管是手术还是保守治疗,效果均不尽人意。X 线和CT 等影像学检查方法是目前诊断ORNJ 的主要临床手段。但是,临床上ORNJ 患者出现疼痛等不适、影像学检查方法发现骨质有改变时,已经意味着ORNJ 处于病情快速发展的阶段。因此,ORNJ 的早期诊断是目前临床上的一个难题,其原因主要就是由于缺乏对ORNJ 早期发现和灵敏监测的手段。通过对比及查阅文献,发现在机体炎症发生发展的过程中,血清中VN 的浓度有了变化[4-5]。那么,在颌骨放射性炎症甚至骨坏死方面其是否也会发生变化呢?本文将利用酶联免疫吸附试验(ELISA)对其在鼻咽癌放疗后未发生ORNJ及ORNJ 患者血清的变化规律进行初步分析,探求其作为预测ORNJ 发生的潜在血清标志物的可能性,现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2011 年10 月-2020 年9 月中山市人民医院发生鼻咽癌放疗后ORNJ 患者与放疗后未发生ORNJ 患者血清各20 份标本,以及20例来自中山市人民医院体检中心正常人的20 份血清标本,分别作为试验组、试验对照组、空白对照组。ORNJ 患者纳入标准:(1)临床诊断为ORNJ 的未经过治疗的鼻咽癌患者;(2)无化疗史;(3)既往有鼻咽癌放疗病史;(4)既往无器质性疾病史;(5)未接受血制品输注者。未发生ORNJ 患者的纳入标准:(1)临床诊断为放疗结束10 年以上且未发生ORNJ 的鼻咽癌患者;(2)无化疗史;(3)既往鼻咽癌病史;(4)既往无器质性疾病史;(5)未接受血制品输注者。所有患者的排除标准:半年内服用氟化物、降钙素等影响骨代谢药物的患者。所有患者依从性好,放疗后定期在专科门诊就诊且每年至少两次在口腔门诊行牙齿洁治等治疗,无拔牙等高危因素发生。空白对照组纳入标准:(1)健康的正常人;(2)无放化疗史;(3)既往无器质性疾病史;(4)无接受血制品输注者。排除标准:(1)曾服用氟化物、降钙素等影响骨代谢的药物;(2)有鼻咽癌家族史。所有患者的放疗及后续回访、放疗后治疗均在中山市人民医院完成,且适用并接受国际抗癌联盟指引的规范化鼻咽癌放疗方案。该研究已经伦理学委员会批准,所有参与者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 所有病例均无手术治疗史,且采用70 Gy 根治剂量。试验组和试对照组病例均采用调强适形放疗。

1.2.2 血清标本采集及处理 血清是在清晨空腹抽取血样,标本于室温下凝固1~2 h 后离心(2 500 g,10 min),血清200 μL 分装,-80 ℃保存。所有标本均在中山市人民医院以统一的条件和方法分离所得。试验血清均仅一次冻融。

1.2.3 主要的实验试剂、耗材和仪器 ELISA 试剂盒(美国GenWay Biotech 公司原产),0412-2 型低速离心机(产地:广州),酶标分析仪(型号:FC,产地:美国)等。

1.2.4 血清VN 的浓度 采用固相、单克隆抗体酶联免疫(ELISA)检测法检测血清VN 的浓度。(1)按照说明进行试剂的稀释以及保存。(2)按照说明进行VN 标准液的配置。(3)提前30 min从4 ℃冰箱中取出试剂盒至室温(25 ℃);轻震荡试剂盒2 min,打开铝箔袋,取出酶标板,将标记孔条放置于酶标板框内。(4)吸取100 μL 抗体-POD 结合物(样品瓶1)至基板的对应孔,随后依次加50 μL 样品、标准品(样品瓶2)及质控液至相应微孔。混合,用铝箔密封微孔板后室温20~30 ℃孵育2 h。(5)用洗涤缓冲液400 μL 吸收、洗净每孔内容物,重复4 次,每次洗涤步骤之间保证微孔内容物尽量被纸巾吸净,特别是在最后一次洗涤以后。(6)基板的孵育:每孔加入100 μL 的底物溶液(样品瓶5),在室温20~30 ℃下孵育15 min。(7)按照同样的顺序在每个孔中依次添加100 μL终止液(样品瓶3),轻轻点叩板混合均匀。(8)立即将所测得样本置于波长为450 nm 可见光处进行测量,得到VN 标准液的OD 值和浓度。为减少误差,每个标本都重复检测2 次,得出结果后取平均值。标准曲线的制作均采用four-parameter logistic 方法进行分析及必要的转换、补充运算。将标准品的浓度以及测得标准品的OD450 值利用计算机软件作相关分析,制作标准曲线,根据标准曲线、质控液OD 值来计算质控液浓度。然后据VN 标准品OD 值和标准液浓度,通过计算机four-parameter logistic 软件计算分析得到血清VN 的标准曲线,得出曲线的拟合方程:y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D,A=4.041 9,B=-1.001 1,C=290.553 2,D=0.038 3,r2=0.999 6。然后,根据血清VN 标准曲线和实验各组血清标本的OD 值,利用four-parameter logistic 软件计算出试验组、试验对照组和空白对照组各血清样本的浓度。

1.3 统计学处理 利用SPSS 16.0 软件进行统计学分析。呈正态分布的计量资料用()表示,多组间比较采用方差分析;不满足正态性分布的采用M(P25,P75)表示,且三组试验数据不满足方差齐性分布,比较采用非参数方法进行统计分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组一般资料比较 试验组20 例,其中男12 例,女8 例;年龄36~64 岁,平均(49.3±3.8)岁;试验对照组20 例,其中男13 例,女7 例;年龄31~78 岁,平均(47.5±4.2)岁;空白对照组20例,其中男10 例,女10 例;年龄33~67 岁,平均(46.9±3.4)岁。三组患者的性别、年龄比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

2.2 三组VN 浓度比较 试验组为19.62(8.97,27.71)ng/mL,试验对照组为2.34(1.34,5.21)ng/mL,空白对照组为19.24(8.49,22.68)ng/mL,试验对照组的VN 浓度低于试验组和空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),而试验组和空白对照组的VN 浓度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

关于ORNJ 发生的机制目前还不是很明了。早在1970 年,Meyer[6]就提出了放疗、感染和创伤“三要素”学说,并认为ORNJ 是由于放疗所引起的颌骨组织活力丧失,然后细菌侵入并造成广泛组织破坏的感染性疾病。但文献[7]通过研究发现,ORNJ局部病灶细菌谱分布广泛,呈现出菌群多样性,且部分患者为无菌性坏死,这些也说明“感染学说”虽然可解释大部分的病例,但却不一定是ORNJ 发生的机制。此后,Marx[8]提出了“三低”学说,认为ORNJ 的发生是由于放疗对骨组织的直接杀伤导致辐照组织内低氧、低血管密度以及低细胞。2004年,Delanian 等[9]提出了放射诱导组织纤维萎缩的观点,认为放疗导致局部损伤组织细胞释放大量的氧自由基从而诱发血管内皮急性炎症性反应,引起局部微血管栓塞,结果导致组织细胞缺血缺氧坏死。在大量的氧自由基的作用下,血管内皮细胞通透性增加,导致大量细胞因子如转化生长因子-β1、肿瘤坏死因子-α、成纤维细胞生长因子-β 等的释放,导致成纤维细胞异常增殖,分泌大量细胞外基质并不断沉积从而吞噬周围组织,最终的结果是颌骨坏死的发生。文献[10]研究也认为,放射诱导的纤维萎缩机制可能在ORNJ 的发生发展过程中发挥了重要作用。王松灵[11]通过建立小型猪下颌骨放射性骨坏死模型,认为放疗对血管内皮细胞的损伤导致局部血流的减少,是引起ORNJ 发生、发展的关键因素。也有观点认为,ORNJ 主要病理过程是骨组织的代谢和自身调节产生障碍,在这一过程中,影响成骨细胞和破骨细胞增殖、凋亡的各种因素均可对骨代谢产生调控作用[12]。孔祥波等[13]采用X射线照射可引起人骨髓间充质干细胞的电离辐射损伤,成功建立了人骨髓间充质干细胞放射损伤的细胞模型,提示ORNJ 发病机制可能和电离辐射有关。葛雅平等[14]对30 余例头颈部肿瘤患者放疗前、放疗30 Gy 后、放疗50 Gy 后的血、尿标本进行了检测,以了解放疗对颌骨骨代谢的影响。结果表明电离辐射能够引起骨代谢特异性生化指标的改变并且这种改变能够在血清中得到较好地反映。

但这些方法主观性很强,所选取的蛋白质不一定能客观反映两者的差异。蛋白组学技术是分离ORNJ 患者血清和正常人群差异蛋白的一种方法。早在2006 年,Menard 等[15]应用蛋白组学技术研究放疗后患者血清中与放疗相关的标志物,发现多种蛋白质碎片或肽类等与放疗相关。孙先阁[16]应用蛋白质组学技术通过分析ORNJ 患者与未发生ORNJ患者血清蛋白质谱的差异表达,寻找到包括VN 在内的ORNJ 患者反映颌骨电力辐射骨代谢的多个差异蛋白质点,这些差异蛋白可能是反映ORNJ 骨代谢的血清标志物。李洁等[17]建立大鼠下颌骨体放射模型,于照射前在大鼠下颌骨体部局部注射特定蛋白质,通过实验观察证实了X 线照射前注射其对下颌骨ORNJ 的发生具有较好的预防作用,结合蛋白质组学的研究,从另一个方面说明ORNJ 发生发展可能存在血清标志物。

人类玻连蛋白是一种多功能的糖蛋白,存在于血浆中,具有黏附功能。其相对分子量为75 000,由一条单链组成。关于VN 在机体感染方面的研究,张春丽[18]认为:脓毒症及脓毒症凝血功能障碍患者血浆标本中VN 水平明显低于正常健康人及社区获得性肺炎患者,VN 水平与脓毒症凝血功能障碍患者PTA 具有显著相关性。VN 在脓毒症凝血功能障碍中发挥重要的作用,且其不同亚型其功能不同。另外,有学者发现冠状动脉疾病患者血清VN 表达水平高于对照组;且随着疾病程度加重,其表达水平呈逐渐升高趋势,提示VN 可能参与了冠状动脉疾病的发病过程[19]。究其发生的机制,文献[20]研究认为VN 参与动静脉血栓形成过程,例如冠心病患者血清中VN 水平高于正常人,且3 支病变者血清中VN 含量显著高于2 支病变者。孙飞等[21]通过实验发现VN 在PTE 中国白兔肺动脉内皮中表达明显上调,VN 可能参与了肺血栓栓塞病程中的血栓形成过程,VN 与PAI-1 或血小板等分子的结合位点或许可成为阻断血栓形成的靶点。这或许是VN参与机体血栓形成导致组织缺血缺氧而坏的原因之一。VN 羧基末端区域包含纤溶酶原结合位点,此区域下游则是由一群碱性氨基酸序列组成的2 个共有肝素结合位点,VN 形成多聚体时暴露此位点,参与Ⅰ型胶原、骨钙素的特异性结合[22],这可能是VN 参与骨代谢的机制之一。但关于VN 在破骨还是成骨方面的作用或变化趋势的报道不尽相同。葛银林等[4]研究发现VN 具有诱导体外分离纯化培养的大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC)向成骨方向分化的作用。Schvartz 等[5]指出VN 含有RGD 序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽序列),通过这段序列VN 可以与αvβ3 受体结合来参与细胞的黏附扩散以及迁移,并已证明能够抑制在体外、内破骨细胞吸收。而玻连蛋白受体也有较多的和破骨相关的基础研究。Horton 等[23]在1985 年就指出玻连蛋白受体(αvβ3)可以作为一种抗体来鉴别组织中的破骨细胞。Chen 等[22]研究雌激素对破骨细胞影响的体外实验:在28 d 对单核细胞和人成骨细胞的联合培养后,巨噬细胞标记CD11b 和CD14 的表达下调,玻连蛋白受体上调。破骨细胞培养28 d 后,17β-estradiol 加入培养细胞中会引起玻连蛋白受体(αvβ3)的明显下降。由此可见,VN 及其受体可能在成骨、破骨方面有着独特的作用。云帆等[24]认为,玻连蛋白对破骨细胞的激活有重要的作用,破骨细胞是一种巨大的多核细胞,起源于单核巨噬细胞/单核系造血前体细胞,在骨吸收过程中发挥重要作用。破骨细胞的形成和活性异常可导致骨质疏松、类风湿关节炎、关节置换后假体无菌性松动等许多疾病,因此破骨细胞是治疗这些疾病的靶点之一。骨盐被认为是破骨细胞识别的重要成分,但是近年来的研究发现骨基质不是破骨细胞激活的必需成分,玻连蛋白包被的培养皿也能使破骨细胞出现骨吸收的特有形态,因此,玻连蛋白对破骨细胞的激活有重要的作用。

虽然VN 在ORNJ 发生、发展过程中的机制尚不明确,但在本研究中,笔者发现了VN 在试验组试验对照组的VN 浓度低于试验组和空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)这可能预示在接受电离辐射及发生颌骨坏死后,其颌骨组织中的破骨细胞活性和破骨细胞介导的骨吸收活动以及成骨细胞活性和成骨细胞介导的骨形成活动在一定时期内的变化规律、方向,进而造成了骨组织的坏死。如果掌握了血清中VN 的变化规律,将有利于对鼻咽癌放疗后ORNJ 的发生有较为准确的预判,从而实施一定的措施,阻止其发生。结合文献,可以初步认为VN 在ORNJ 中起到一定作用,可能是ORNJ发生的血清标志物。

本试验样本量小极有可能导致检验功效偏低,仍然有可能导致假阳性假阴性结果的出现。后续的研究需要进一步扩大样本量、严格入组条件,减少临床个体差异对检测结果造成的影响和偏差,建立和完善ORNJ 相关的血清蛋白质指纹图谱数据库。另外,对选定更多数量的鼻咽癌患者进行跟踪检查,以获得其血清标志物的动态变化趋势从而有效预测鼻咽癌放疗后ORNJ 的发生。

猜你喜欢

骨细胞鼻咽癌空白对照
非编码RNA在鼻咽癌转移中的研究进展*
LncRNA在骨质疏松中对破骨细胞作用的研究进展
小麦不同肥力下经济效益试验研究
外源性透明质酸对人牙周膜细胞增殖及成牙骨质、成纤维分化的影响
破骨细胞能量代谢的研究进展
保守与手术治疗鼻咽癌放疗后慢性鼻-鼻窦炎的疗效比较
成骨细胞调节破骨细胞功能的机制及途径研究进展
例析阴性对照与阳性对照在高中生物实验教学中的应用
中医药治疗鼻咽癌研究进展
骨细胞在正畸牙移动骨重塑中作用的研究进展