陈风晔，刘孟雨，周雅博，梁晓雨，黄 波，解 静

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室 免疫学系，北京 100005)

穿孔素(perforin,PRF)是存在于细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTLs)和天然杀伤细胞(naturalkillercell, NK)胞质毒颗粒中的糖蛋白，由550个氨基酸组成，分子量为67 ku。穿孔素为单链结构，N端以亲水性氨基酸为主，C端则以疏水性为主，穿孔素单体分子被释放后，在Ca2+存在下活化形成10个以上单体分子组成的管状结构多聚体，通过其疏水C末端插入细胞膜发挥作用[1]。CTLs和NK细胞可通过穿孔素—颗粒酶途径来防御病毒感染或异常细胞侵袭[2-4]。CTLs与靶细胞膜表面抗原接触，穿孔素被激活后在靶细胞上形成跨膜孔洞，颗粒酶进入细胞，活化caspase级联反应，导致靶细胞凋亡[1,5-6]。目前商品化的穿孔素基本上都是使用酵母表达系统表达的蛋白，并不具备细胞打孔活性，难以获得大量高活性的穿孔素，现有的穿孔素相关研究受到很大的局限。因此优化穿孔素的纯化方法具有重大意义。故本文旨在用一种简单方法在昆虫细胞中表达并纯化出有活性的人穿孔素，为相关研究的推进提供一定的帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体和细胞系：人乳腺癌细胞系MCF-7(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)；昆虫草地贪夜蛾细胞sf9(spodoptera frugiperda cell 9)和pFastBac1载体(Thermo Fisher公司)。

1.1.2 试剂：DNA酶、PrimeSTARHS DNA Polymerase with GC Buffer、5× In-Fusion HD Enzyme Premix和电泳缓冲液(TaKaRa公司)；快速内切酶EcoRⅠ、CellfectinTMⅡ Reagent、快速内切酶XbaⅠ、Grace’s Insect Medium和碘化丙啶(Thermo Fisher公司)；Agrose(Invitrogen公司)；杆状病毒穿梭载体bacmid小量抽提试剂盒、考马斯亮蓝超快染色液、亲和层析柱空柱管(12 mL)、和快速银染试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；……