黄琪淋，温 莎，叶绍燕，万逢洁，何 敏,

(1. 广西壮族自治区龙潭医院急诊医学科，广西 柳州 545005； 2. 广西医科大学实验动物中心，广西 南宁 530021； 3. 柳州市疾病预防控制中心环境与学校卫生防治所，广西 柳州 545007； 4. 广西医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室，广西 南宁 530021)

肺结核是由结核分枝杆菌感染肺部形成的一种慢性传染病，其中涂阴肺结核约占肺结核患者总数的一半[1]。涂阴肺结核患者早期不易被及时发现，易漏诊、误诊。然而，结核病的延迟诊断可能会增加疾病的严重程度和病死率，并加大传播风险。在一项横断面调查[2]中发现，涂阴肺结核导致结核患者延迟治疗风险比为2.3倍。在撒哈拉以南非洲地区的一项研究[3]中，涂阴肺结核患者对该地区的结核病控制项目构成了巨大的负担，其中三分之一的涂片阴性结核病患者在初诊后一年内死亡，三分之一患者可能发生复发性肺结核。因此，寻求一种灵敏度高、特异度强的涂阴肺结核血清标志物是结核病研究关注的热点。近年来，血清蛋白组学技术为结核病的辅助诊断提供了契机[4]。本课题组前期血清蛋白组学的研究中发现性激素结合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)及血清淀粉样蛋白4(serum amyloid A4，SAA4)在血清中的差异表达，并且目前在国内外研究中除本课题组外尚未见有关血清SHBG及SAA4辅助诊断涂阴肺结核的相关报道，因此，本研究通过检测涂阴肺结核血清潜在标志物，即SHBG及SAA4在血清中的表达水平，并应用受试者工作特征(ROC)曲线进一步评估两项指标的辅助诊断效能，为涂阴肺结核的辅助诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采集2017年3—5月广西柳州市龙潭医院收治的88例涂阴肺结核患者的血清标本，参照中华医学会制定的《临床诊疗指南结核病分册》[5]进行涂阴肺结核患者的诊断，排除合并肿瘤、严重器质性病变、免疫功能低下的肺结核患者。同一时期采集56例广西柳州市本地区的健康体检人员的血清标本作为健康对照组，排除结核、肺炎、尘肺、肿瘤及其他严重肺部疾病患者。

1.2 血清SHBG、SAA4蛋白含量检测 采集研究对象空腹时外周静脉血3 mL，4℃静置2 h，3 000 r/min离心5 min，取上层血清：(1)血清稀释100倍后，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法(试剂盒购于R&D Systems公司)检测两组血清SHBG蛋白含量；(2)血清稀释10倍后，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法(试剂盒购于LifeSpan BioSciences公司)检测两组血清SAA4蛋白含量。检测过程均严格参照试剂盒说明书进行操作。

1.3 近三年涂(菌)阴肺结核的结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测方法分析

1.3.1 检索策略 检索三大中文数据库：万方数据库、中国知识基础设施工程(中国知网数据库)、维普数据库于2016年1月1日至今发表的中文文献，按照下述条件进行检索：(涂阴肺结核 OR 菌阴肺结核)AND(灵敏度 OR 敏感度 OR 特异度)AND(T-SPOT OR ELISPOT OR 酶联免疫斑点技术 OR γ-干扰素释放试验)。

1.3.2 文献纳入与排除标准 纳入标准：(1)患者明确诊断为涂阴肺结核或菌阴肺结核；(2)应用T-SPOT.TB检测方法；(3)数据能直接提取四格表数据或经计算得出四格表数据；(4)病例及对照样本数均>40例；(5)文献为中文期刊发表论文。排除标准：(1)无法提取四格表数据；(2)综述或Meta类文献；(3)数据有限的摘要文献；(4)重复文献。

1.4 涂阴肺结核血清学指标诊断效能评价标准 根据比较灵敏度、特异度、曲线下面积(area under curve，AUC)、约登指数指标来评估各项研究中T-SPOT.TB检测方法的涂阴肺结核诊断效能。

1.5 统计学方法 应用SPSS 20.0进行数据分析，定量资料采用中位数(四分位数间距)[M(P25～P75)]表示，组间比较采用Mann-Whitney U非参数检验。绘制ROC曲线，并计算曲线下面积、灵敏度、特异度、约登指数。应用MedCalc 16.2软件进行Z检验，比较ROC曲线AUC的差异，进而评价单一与联合指标诊断涂阴肺结核的诊断效能。采用卡方检验分别进行涂阴肺结核SHBG与SAA4两者联合诊断试验与近三年涂(菌)阴肺结核的T-SPOT.TB检测方法的灵敏度和特异度比较。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本情况 88例涂阴肺结核患者中男性51例，女性37例，平均年龄(49.49±16.13)岁；56例健康体检人员中男性36例，女性20例，平均年龄(46.80±9.88)岁。两组间年龄、性别比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，资料具有可比性。

2.2 血清SHBG与SAA4蛋白表达水平 ELISA法检测结果显示：涂阴肺结核组血清SHBG与SAA4蛋白浓度分别为52.32(24.58～81.19)nmol/L、56.71(41.87～77.57)ng/mL，健康对照组SHBG与SAA4蛋白浓度分别为25.97(16.60～36.45)nmol/L、35.79(29.81～41.07)ng/mL。涂阴肺结核组血清SHBG与SAA4蛋白表达水平高于健康对照组，差异均有统计学意义(均P<0.001)。见图1。

图1 血清SHBG、SAA4蛋白的表达水平

2.3 SHBG、SAA4单一及联合诊断涂阴肺结核的ROC曲线 对88例涂阴肺结核患者及56例健康对照组血清SHBG、SAA4蛋白的检测结果绘制ROC曲线，结果表明两指标联合诊断时曲线下面积AUC为0.906(95%CI:0.857～0.955)(P<0.001)。见表1、图2。应用Z检验比较ROC曲线的结果如下：SHBG、SAA4两者联合诊断涂阴肺结核的效能明显优于单一指标的诊断效能(P<0.001)，而比较SHBG、SAA4单项诊断涂阴肺结核时，两蛋白指标的单独诊断效能差异均无统计学意义(均P>0.05)。

表1 SHBG与SAA4联合诊断涂阴肺结核的诊断效能

图2 SHBG、SAA4单一及联合诊断涂阴肺结核的ROC曲线

Figure2ROC curves of single and combined detection of SHBG, SAA4 for SNPT

2.4 近三年涂(菌)阴肺结核的T-SPOT.TB检测方法分析 共检索到102篇相关文献，其中万方数据库79篇、中国知网数据库20篇、维普数据库3篇，按照纳入及排除标准，最终纳入12篇中文文献，排除90例，其中64篇无法提取四格表数据，11篇样本例数少于40，3篇为综述或Meta类文献，10篇为重复文献，2篇为非T-SPOT.TB检测方法。从近三年已报道涂(菌)阴肺结核的T-SPOT.TB检测方法的诊断效能来看，表2显示各研究中的T-SPOT检测技术在诊断肺结核时其诊断效能结果不一致，本研究的联合诊断特异度不比T-SPOT.TB检测方法差，在灵敏度上T-SPOT.TB检测技术除两项研究比本研究的联合诊断灵敏度高外，其他均无统计学意义(均P>0.05)，且本研究联合诊断的约登指数为0.752，与这12项研究相比具备较好的准确性，可见SHBG与SAA4两者联合诊断涂阴肺结核具有比较优势。

3 讨论

在结核病的流行过程中，相对于涂阳肺结核患者，涂阴肺结核患者的结核传播率约为22%[18]，且肺结核病例中约有一半的涂片呈阴性[1]，意味着结核病的整体负担严重，将加大结核病的防控难度。因此，快速准确地诊断涂阴肺结核病对于促进疾病早期治疗的开始，改善患者的预后和减少结核病传播至关重要。近年来血清学检测技术被广泛应用于临床疾病工作中，有研究[19]表明该项技术有助于结核病的辅助诊断，且血清学检测对于痰量达不到标准的患者(如儿童、HIV/AIDS患者)和肺外结核患者具有一定的优势。因此，迫切需要寻找一种应用多项血清学指标联合诊断结核病的方法。

表2纳入12篇文献中近三年涂(菌)阴肺结核的T-SPOT检测技术比较

Table2Comparison of T-SPOT detection technique of SNPT in 12 literatures in recent three years

第一作者病例组(例)对照组(例)灵敏度特异度约登指数李振生[6]170640.971* 0.652# 0.623郝兴亮[7]66400.864 0.900 0.764何 莉[8]1947440.866 0.808 0.674任甜甜[9]168810.792 0.630# 0.421严松盛[10]1021000.794 0.640# 0.434杨映晖[11]491150.714 0.826 0.540彭 宁[12]135790.822 0.924 0.746周前选[13]185640.778 0.688# 0.466李爱英[14]1561440.955* 0.896 0.851蔡向敬[15]1142030.856 0.714# 0.570何梅芳[16]93400.849 0.900 0.749王甲甲[17]77890.8960.764#0.660

*：与SHBG+SAA4联合诊断灵敏度相比，差异有统计学意义(P<0.05)；#：与SHBG+SAA4联合诊断特异度相比，差异有统计学意义(P<0.05)

本课题组在前期研究中利用血清蛋白组学技术筛选出了肺结核患者血清差异表达蛋白SHBG与SAA4，在此基础上，本研究进一步鉴定了SHBG、SAA4蛋白在涂阴肺结核患者血清中均高表达，预示着该蛋白可能作为涂阴肺结核患者诊断血清学候选标志物。因此，本研究运用ROC曲线进一步评价这两种蛋白对涂阴肺结核的辅助诊断价值。在评估SHBG与SAA4蛋白单独及联合诊断涂阴肺结核时，发现联合诊断效能明显高于单个蛋白指标的诊断效能，其中联合诊断的ROC曲线下面积可达0.906(95%CI:0.857～0.955)，且灵敏度为84.1%，特异度可达91.1%。近年来，新的检测技术γ-干扰素释放试验已经被引入到肺结核临床诊断中且表现出较高的诊断价值，我国主要使用结核感染T-SPOT.TB试剂盒，该试验主要通过测定由结核分枝杆菌特异性抗原刺激效应T细胞产生的γ-干扰素来判断被检者有无结核病或是否存在结核感染。与近三年的涂(菌)阴肺结核的T-SPOT.TB检测方法比较，本研究的联合诊断的特异度不比T-SPOT.TB检测技术差，在灵敏度上T-SPOT.TB检测技术除两项研究比本研究的联合诊断灵敏度高外，其他均无统计学意义，且本研究的约登指数0.752与纳入的这12项研究的约登指数相比，具备较好的准确性，表明该联合诊断试验的真实性好，能较好地发现真正的涂阴肺结核患者，可见SHBG与SAA4两者联合诊断涂阴肺结核具有比较优势。因此，本研究发现的联合检测SHBG、SAA4蛋白为涂阴肺结核患者提供了良好的辅助诊断价值。同时还发现虽然本研究与周颖等[20]研究中应用的SHBG蛋白检测试剂盒均来自R&D公司，但两项研究中SHBG单一指标诊断涂阴肺结核的诊断效能存在差异，除了样本的差异外，可能还与两项研究购买的科研试剂盒由于批次不同而存在检测结果不稳定的因素有关，可见，检测试剂盒向临床应用推广需实行标准化生产管理，以达到临床指标稳定检测的效果。

目前对于两种蛋白引起肺结核患者体内差异表达的作用机制尚不清楚。结核病被称为消瘦性疾病，结核患者脂联素水平增高[21]，脂联素可以通过肝脂质含量的变化水平上调肝细胞核因子-4A，最终促进肺结核患者体内SHBG的表达增加[22]。SAA4是一种组成型蛋白，属于SAA蛋白家族，可作为对损伤或炎症本身的反应产物，SAA4蛋白被发现在结肠癌及卵巢癌中表达增加[23-24]，影响癌症的发生发展；同时De等[4]通过SOMAscan蛋白质组学平台对来自于7个结核病流行国家的血清标本进行了深入分析，筛选出了结核患者722种差异表达蛋白，其中SAA蛋白在结核患者中表达增加，且与非结核患者相比，该蛋白的中位数倍数变化最大，达7.99倍。在感染结核分枝杆菌期间，结核病患者响应炎症刺激引起机体血液高凝状态[25]，有研究[26-27]表明，SAA的升高可能与这些患者慢性感染分枝杆菌引起机体凝血途径活化与抗凝血受损相关。相比于De的研究，本研究准确突出SAA蛋白家族里的SAA4蛋白在涂阴肺结核患者中的高表达和结核诊断价值。

鉴于本研究SHBG与SAA4蛋白联合诊断涂阴肺结核显示出较高的灵敏度及特异度，下一步本课题组将继续扩大样本量进行两种蛋白对涂阴肺结核联合诊断效能的多中心评价试验，为探讨提高涂阴肺结核患者的诊断率以及辅助诊断提供经济、高效、实用的新方法。