王傲晨，陈旭

（中国医科大学口腔医学院儿童口腔科，辽宁省口腔疾病重点实验室，沈阳 110002）

再生医学是一门研究如何促进创伤后组织再生及功能重建的新兴学科，主要通过干细胞治疗与组织工程来改善、修复或再生损伤组织。免疫反应贯穿组织再生与修复的整个过程，并发挥双刃剑作用。既可以早期促进创面关闭，确保受损组织得到及时保护，避免再度感染，又可以导致组织纤维化，形成影响解剖结构和功能的瘢痕组织［1-2］。因此，维持再生微环境的免疫稳态，是再生医学研究的关键。

间充质干细胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）是存在于骨髓、脂肪、肌肉、脐带和牙髓等多种组织中的多功能干细胞，除了具有自我更新和多向分化的潜能外，还具有良好的免疫调节能力。在慢性损伤的组织中，MSCs不仅具有直接分化再生组织的能力，而且可通过细胞与细胞直接接触或旁分泌作用调节免疫细胞活性，维持局部微环境的稳态［3］。基于免疫反应在组织再生过程中的重要作用，以及MSCs对免疫细胞增殖、分化及功能的调节能力，MSCs已被广泛应用于组织再生和自身免疫性疾病的治疗中。

目前，更多的证据倾向于MSCs通过旁分泌作用发挥其免疫调节功能，其旁分泌物质主要包括细胞外囊泡和细胞因子。外泌体直径介于30～150 nm，密度为1.13～1.19 g/mL，具有脂质双分子层的囊泡结构，透射电镜下观察具有典型的“杯口状”形态，含有大量蛋白质、脂质、DNA、mRNA和非编码RNA等，在细胞间的通讯过程中起重要作用［4］。近年来研究［5］表明，MSCs来源的外泌体 （mesenchymal stem cells-derived exosomes，MSC-Exo） 与MSCs有着相似的功能，包括调节机体免疫，抑制过度的炎症反应和促进组织的修复与再生等。外泌体作用于靶细胞的途径有3种:（1） 外泌体通过靶细胞胞吞作用被摄入到细胞内或通过细胞膜融合的方式与靶细胞膜融合，直接释放含有的活性物质及信息到靶细胞；（2）外泌体膜蛋白可直接与靶细胞表面受体相结合，并激活细胞内的信号通路，将细胞外信号传递到细胞内，从而进行信息交流，这种信息传递方式同样常见于免疫系统。例如，外泌体膜外蛋白乳脂肪球上皮生长因子8可以与树突状细胞和巨噬细胞表面的整合素结合，是外泌体与抗原提呈细胞识别的主要途径；（3） 外泌体膜蛋白可被细胞外间隙的蛋白酶切割，裂解的片段可作为可溶性配体，与目标细胞表面受体结合，完成信息传递。

利用MSC-Exo替代MSCs治疗自身免疫疾病和组织再生，逐渐成为研究的新热点。本文将对MSCExo通过调节免疫促进组织再生的作用与机制研究进展进行综述。

1 MSC-Exo通过调节巨噬细胞分化促进组织再生

大多数组织中存在巨噬细胞，但更多的巨噬细胞在组织损伤后被招募。除了发挥吞噬细胞碎片、侵入生物体、中性粒细胞和其他凋亡细胞的作用外，巨噬细胞还活跃调节组织的愈合过程。在组织微环境的作用下，巨噬细胞增殖并发生显著的表型和功能变化。巨噬细胞包括2种类型，即促炎表型（M1型） 巨噬细胞和抗炎表型 （M2型） 巨噬细胞。在组织修复早期阶段，活化的M1型巨噬细胞分泌活性氧和炎性细胞因子如白细胞介素 （interleukin，IL）-1β，IL-6和肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factoralpha，TNF-α），产生高水平的诱导型一氧化氮合成 酶 （inducible nitric oxide synthase，iNOS）［6］。这些细胞可杀伤微生物，清除碎片以及促进辅助性T细胞1 （T helper 1，Th1） 分化。而在修复过程后期，活化的M2型巨噬细胞表达IL-10、转化生长因子β1（transform growth factor-β1，TGF-β1） 和甘露糖受体，并产生精氨酸酶代替iNOS，从而降低炎症反应，促进细胞增殖和组织再生［7］。因此，促进未极化的巨噬细胞向M2型极化有利于受损组织的修复与再生。

MSC-Exo的一个重要免疫调节特性是促进M2型巨噬细胞极化，增强抗炎细胞因子的表达，从而降低局部的炎性反应。LO SICCO C等［8］发现，在正常和缺氧条件下培养的脂肪MSCs能够释放具有抗炎作用的外泌体，当其与巨噬细胞共培养时，可被有效内化，在短期内促进巨噬细胞增殖，并增强巨噬细胞由M1型向M2型极化；体内实验研究显示，MSC-Exo可有效降低骨骼肌损伤小鼠的局部炎症反应，并增强肌源性标记物的表达，证实MSC-Exo具有调节巨噬细胞极化的能力，在骨骼肌组织修复与再生中可能有潜在的应用价值。另一项研究［9］发现，在免疫功能正常的大鼠中，人胚胎MSC-Exo可以促进软骨细胞增殖和基质合成，在软骨缺损处M2型巨噬细胞浸润较M1型巨噬细胞更多，同时炎性细胞因子IL-1β和TNF-α表达降低，从而促进软骨修复；进一步体外研究发现，MSC-Exo的CD73蛋白可诱导软骨细胞中AKT和ERK的快速磷酸化，而这种磷酸化在诱导细胞迁移和增殖中起关键作用。应用CD 73抑制剂传递信号可导致AKT和ERK磷酸化衰减，进一步证实了外泌体中CD73的作用。这些研究表明巨噬细胞在MSC-Exo介导的软骨再生中发挥重要作用。此外，在高氧诱导的小鼠肺损伤模型中，MSC-Exo的局部输入可促进周围组织中M2型巨噬细胞极化，使组织中促炎细胞因子水平降低，重塑肺部微环境，减少组织纤维化和微血管丧失，同时改善肺功能［10］。因此，MSC-Exo可通过调节巨噬细胞极化促进组织再生，为MSCs无细胞治疗提供了基础，但在进行临床试验之前仍需对MSC-Exo的作用机制进行深入研究。

2 MSC-Exo通过促进调节性T细胞 （regulatory T cells，Tregs） 转化促进组织再生

随着人们对特异性免疫，尤其是T细胞在组织再生调节作用中的认识逐渐深入，T细胞在再生微环境中的作用成为新的研究热点。T细胞分为若干亚群如细胞毒性T细胞、Th1、Th2、Th17以及Tregs细胞等。其中，Tregs是一类具有免疫抑制作用的CD4+CD25+Foxp3+T细胞亚群，可分泌IL-4、IL-10、TGF-β等细胞因子，负向调节免疫反应，维持机体免疫系统稳态，并为巨噬细胞极化提供一个有利的抗炎微环境［11］。Tregs在骨骼、皮肤和心肌再生中的重要作用均已得到证实［12-13］。例如，在小鼠皮肤受损后，伤口早期聚集大量高度活化的Tregs，抑制了γ干扰素 （interferon-γ，IFN-γ） 的产生和M1型巨噬细胞的集聚，同时诱导表皮生长因子受体的表达，揭示了Tregs在促进皮肤伤口愈合中的作用［14］。另有研究［15］表明，活化的Tregs促进中性粒细胞分泌抗炎分子，包括IL-10和TGF-β和吲哚胺2，3-双加氧酶，抑制中性粒细胞IL-6的产生，进而维持再生微环境稳态，间接促进组织再生。在肾缺血再灌注损伤模型中，Tregs通过分泌IL-10抑制中性粒细胞浸润，有效减轻肾损伤［16］。而Th17是一类分泌IL-17A、IL-17F、IL-21和TNF-α多种炎性细胞因子的T细胞亚群，与Tregs在分化和功能上相互抑制［17］。YI等［18］发现通过抑制脊髓损伤小鼠的Th17分化，可降低局部炎症反应，有利于脊髓的再生和功能恢复，功能性验证了T细胞可通过调节免疫反应促进组织再生。因此，Th17与Tregs的动态平衡是维持免疫微环境的关键，更是组织再生成功的前提。

MSC-Exo对T细胞转化的诱导，是其维持免疫稳态，促进组织再生的重要途径之一。体外实验发现，CD3/CD28双抗体激活的CD4+T细胞可在TGF-β1和IL-2的诱导下向Tregs转化，而在诱导体系中加入MSC-Exo后，Tregs比例显著升高，说明MSC-Exo可促进Tregs转化。而另有研究［19］证实，MSC-Exo不仅可诱导Th1细胞向Th2细胞的转化，同时还抑制T细胞向Th17细胞的分化，说明MSC-Exo对T细胞转化具有显著的调控作用。在小鼠的皮肤移植实验［20］中发现，人胚胎MSC-Exo可增加Tregs比例，并延迟移植物的排斥反应；而在未接受皮肤移植的小鼠中，外泌体并不能使Tregs比例增加，这表明MSC-Exo诱导Tregs的转化依赖于激活的免疫系统。此外，MSC-Exo也可被外周血中单个核细胞胞吞，通过上调IL-10和TGF-β1的表达水平，促进Tregs的增殖与转化，从而减轻哮喘小鼠的气道炎症反应［21］。LI等［22］发现，MSC-Exo携带的鞘氨醇-1-磷酸可与CD4+T细胞表面鞘氨醇-1-磷酸受体1结合，并促进CD4+T细胞向Tregs转化；体内研究发现，系统性输入MSC-Exo可上调再生障碍性贫血小鼠外周血中Tregs/Th17比例，降低IL-17表达水平，并有效延缓疾病的进展。这些研究表明MSC-Exo可通过上调Tregs发挥免疫抑制作用，为组织再生提供适宜的微环境。

3 MSC-Exo通过微小RNA （microRNA，miRNA） 调节免疫反应促进组织再生

外泌体作为一类内源性微囊泡，是细胞间核酸及蛋白转运的主要介质，其中miRNA被认为是外泌体调控受体细胞的主要物质。miRNA是一种由18～25个核苷酸组成的内源性微小单链非编码RNA分子，通过与靶基因中的碱基配对互补，在转录后水平负性调节基因表达，最终导致靶基因的抑制或降解。外泌体含有多种miRNA，并可以通过转运miRNA调控受体细胞的基因转录，影响受体细胞的生物学功能。2017年，有学者［23］发现骨髓MSCExo可以提高视网膜神经节细胞存活率，促进其轴突的再生；敲除miRNA发挥功能的关键协同蛋白Argonaute-2后，骨髓MSC-Exo对视网膜神经节细胞保护作用和轴突再生能力明显降低，表明miRNA是骨髓MSC-Exo发挥神经保护和再生作用的关键。另一项研究［24］显示，脂多糖预处理的脐带MSC-Exo，其外泌体携带的miRNA let-7b表达量升高；并且，let-7b可通过抑制TLR4/NF-κB通路和激活STAT3/AKT信号传导通路调节巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，从而促进创面愈合。

miRNAs可调节多达1/3的蛋白质编码基因，其在免疫反应的不同阶段均发挥作用，包括免疫细胞的转化和诱导，以及细胞内稳态和功能的维持［25］。虽然目前关于MSC-Exo中miRNA通过调控免疫促进组织再生的研究尚少，但随着高通量测序技术的不断成熟，miRNA表达谱分析将对MSC-Exo免疫调节和再生应用的研究有更好的启示作用。

综上，MSC-Exo具有良好的免疫调节作用，可通过增强M2型巨噬细胞的极化及Tregs转化，抑制促炎细胞因子的表达，降低局部的炎症反应，从而促进组织再生。MSC-Exo作为一种无细胞制剂，既避免了干细胞治疗的免疫排斥反应，也不存在伦理争议，在组织再生中体现出较好的应用前景。而MSCExo在人体内应用的方式、剂量以及长期安全性还有待评估。随着对MSC-Exo的免疫调节作用机制的研究深入，其对组织再生的作用与机制将更加清晰。