潘婷婷，张娟

（中国药科大学 生命科学与技术学院，江苏南京 211198）

目前已知的许多罕见病，如血友病、杜氏肌营养不良等，都是由特定基因的缺陷导致的。基因疗法将治疗核酸递送至靶细胞，可以纠正致病的基因缺陷，持续表达治疗性蛋白或沉默有害突变，从而实现长效治疗的目的。重组腺相关病毒载体（Recombinant Adeno-Associated Viral Vector，rAAV）因其基因毒性低，可在多种组织中高效长期表达蛋白以及低免疫原性等特性，正逐渐成为基因治疗的主要载体。目前，已有3种基于AAV的基因疗法分别在欧盟和美国获批上市，美国食品药品监督管理局（FDA）的报告预计每年将有10～20种新的细胞治疗或基因治疗产品上市。

对腺相关病毒（AAV）基因组结构、病毒组装以及生活周期的深入了解，使得其作为基因疗法载体成为可能。AAV为直径约26 nm的二十面体单链DNA病毒，基因组大小约为4.7 kb，共编码Cap、Rep和aap 3种基因，基因两端为反向末端重复序列（Inverted terminal repeats，ITRs）。作为基因疗法载体的rAAV删除了所有病毒蛋白的基因，只保留与病毒复制和包装相关的末端ITR序列，并在ITR之间插入治疗性转基因及必要的表达调控元件，病毒蛋白则以反式作用因子的形式提供。删除病毒蛋白基因不仅可将AAV携带转基因的容量最大化，还可以减小免疫原性和细胞毒性。由于rAAV载体不表达Rep蛋白，其整合至宿主基因组的能力大幅减弱，从而降低了插入突变引起的基因毒性。rAAV基因组可在细胞核内形成长期存在的环状串联体，从而实现转基因的长期表达。低免疫原性、低基因毒性、衣壳蛋白多样、作用时间长以及易于生产等特性使得AAV非常适合作为基因疗法的载体。

虽然目前AAV载体在临床上取得了初步的成功，但有关AAV载体转导效率以及宿主对AAV转导细胞产生免疫反应的担忧使得研究者们仍需不断改造和优化AAV载体结构、衣壳蛋白以及大规模生产工艺，以提高AAV对靶细胞的转导效率、拓宽靶细胞范围、避开宿主免疫反应以及提高临床可及性。本文将对AAV载体和衣壳蛋白工程改造的研究进展进行梳理。

1 重组腺相关病毒载体设计及优化

设计AAV载体时首先需要考虑的是AAV的包装能力。当AAV基因组小于5 kb时，病毒的包装效率较高[1]。然而，许多治疗性蛋白以及基因编辑核酸酶的编码序列长度都远大于5 kb以至于无法有效地包装进rAAV病毒颗粒中。针对这类情况，除了采用该蛋白的活性截短体外[2]，还可以利用AAV基因组能通过ITR序列或重叠序列之间的同源重组连接成多联体的特性，将长基因片段分别包装于两个或多个AAV载体中以扩大AAV载体能递送的片段长度。有研究将耳畸蛋白5'部分和3'部分的cDNA编码序列分别插入两个含有重组桥接序列的AAV载体中，并在5'-和3'-cDNA后分别引入剪接供体和受体位点，从而实现长达6 kb的外源基因的递送[3]。这些双AAV载体的包装序列有部分重叠，可在细胞内通过分子间重组连接多个AAV载体，然后利用重组序列两侧的剪切信号来精确切除前mRNA中的重组序列，从而得到完整的转基因片段[4]。还有的研究利用了内含肽（Intein）介导的蛋白反式剪接（Protein transsplicing）将多个AAV载体表达的目的蛋白片段精确连接为全长蛋白[5]。

AAV载体完整的转导通路包括与宿主细胞表面受体结合，形成内涵体，胞浆运输，转运至细胞核/蛋白酶体介导的降解，病毒脱壳，单链DNA复制为具有转录活性的双链DNA，通过ITR序列重组形成可在细胞核内长期存在的环状外泌体DNA。因此，除了AAV包装容量外，AAV衣壳蛋白的嗜性、细胞核转运的效率以及转变为双链DNA的效率等，均会影响AAV的转导效率以及目的基因的表达。其中，双链DNA的合成是目的基因表达的限速步骤。有学者通过突变AAV基因组DNA一端的ITR序列使其成为可自身互补的双链AAV载体（Self-complementary AAV，scAAV），从而避免了双链DNA合成步骤对目的基因表达的影响，然而AAV载体的包装容量会减少至3.3 kb左右[6]。

AAV表达载体中不同顺式作用元件的组合可满足不同的治疗需求。例如，选择合适的增强子和启动子来提高转基因表达水平、实现组织特异性表达等。在多数情况下，rAAV基因表达盒会使用高转录活性的组成型启动子，如巨细胞病毒（CMV）启动子，来实现目的基因的高表达；表达RNA分子时通常会使用人或鼠的U6小核RNA启动子和人H1启动子来驱动短发夹RNA和单链向导RNA的表达，以达到基因沉默或基因编辑的目的。其他调控元件，如内含子和土拨鼠肝炎转录后调控元件（Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element，WPRE）等，可改善mRNA的转运及稳定性，从而增强基因表达[7-8]。由于AAV载体包装能力的限制，载体所使用的顺式作用元件需保持较小的尺寸。目前，有研究通过缩短肝特异性启动子的长度以及结合不同增强子的方法，生成了42种小尺寸的启动子/增强子组合，在实现有效包装的同时也提高了组织特异性启动子的转录活性[9]。近年来，有学者使用计算机模拟的方法在全基因组规模上筛选出了长度在41～551 bp，包含进化上保守的转录因子结合位点基序簇的14种肝细胞特异的顺式作用调节模块，有助于采用模块化组装的策略合理设计肝特异性启动子[10]。

天然的蛋白基因序列未充分利用宿主细胞的最优选密码子来表达蛋白，或者转基因序列GC含量过高，存在隐蔽的剪接位点、转录终止信号以及影响RNA稳定性的基序等缺点，均会影响转基因的表达水平。因此，用于rAAV基因治疗的转基因序列需依据靶细胞的类型进行相应的密码子优化，以增强转基因表达水平[11]。

近年来的研究表明，3'端非翻译区序列（3'untranslated Regions，3'UTR）在结合miRNA、调节mRNA稳定性和翻译调控等过程中具有重要作用。许多研究发现，在rAAV基因组的3'UTR中引入miRNA122a（在肝中特异性表达）结合位点，可降低转基因在正常肝组织中的表达，从而实现肝脱靶、减少全身给药时的rAAV载体用量以及提高基因疗法的特异性和疗效[12]。上述策略还可用于减少机体对转基因表达产物的免疫原性，对转基因产物在体内的长期表达具有重要意义[13]。在3'UTR中引入miRNA142（抗原呈递细胞中丰度较高）结合位点可显著减少转基因在抗原呈递细胞中的表达，进而避免因机体免疫系统清除表达转基因产物的细胞，并导致基因疗法疗效降低[14]。

2 重组腺相关病毒衣壳开发和优化

rAAV载体衣壳蛋白的特性对其细胞靶向性、相关的预存免疫反应以及转导效率等有重要影响，研究人员通过对衣壳蛋白的改造可赋予其新的功能特性。衣壳开发方法包括天然发现、合理设计、定向进化和计算机发现（in silico discovery）策略[15]。目前，临床上使用的大多数AAV血清型都是天然来源的，如从人类肝脏组织中分离出的AAV9可以穿越血脑屏障，递送基因至中枢神经系统中。然而，流行病学数据显示40%～80%的人有针对人源AAV的中和抗体，这会阻碍AAV载体对靶细胞的转导。因此，从非人灵长类以及其他脊椎动物中分离出的新型AAV血清型，如AAVrh.8、AAVrh.10和AAVrh.43等[16]，可以克服这一问题。然而，天然存在的AAV血清型并不能很好地适应临床需求，仍需进一步改造和优化。

基于对常用AAV衣壳蛋白结构与功能、与宿主细胞受体的结合以及转导过程的研究，人们可以通过理性设计的手段改良病毒载体衣壳，提高转导的特异性和效率。例如，有研究将AAV9中结合多糖受体的基序嵌合到AAV2中来增加AAV2与细胞的结合，提高转导效率[17]；还有学者利用小鼠体内模型来筛选由随机核苷酸序列插入到AAV2 VP1的588碱基处构建的AAV展示肽文库，从而获得转导效率高且拥有特定组织特异性的病毒衣壳序列[18]。除了整合特定多肽序列外，有学者通过影响转导通路，如将暴露在AAV衣壳表面的酪氨酸残基突变，抑制其磷酸化和泛素化修饰，来减少AAV载体在蛋白酶体中的降解，从而将转基因在肝细胞中的表达水平提高了 30 倍[19]。

理性设计的方法也只能发现有限的AAV衣壳变体。使用定向进化的手段，可以在不了解AAV载体作用机制的背景下，对不同策略构建的AAV多肽库进行大规模体外/体内加压筛选，从而富集有益的衣壳蛋白变体，是一种高效的发现全新AAV载体的方法。构建多样化的AAV衣壳文库的方法主要有易错PCR，基因改组生成嵌合衣壳、特定位点插入随机多肽片段、衣壳表面高变成环区域的随机替换[20]。其他定向进化技术还包括蛋白质片段的靶向重组、理性设计与定向进化相结合、基于Cre重组的AAV定向进化（Cre recombination-based AAV directed evolution，CREATE）以及体内定向进化技术，这些技术已被广泛用于AAV载体的开发[21]。其中，CREATE技术可用于筛选出能有效转导表达Cre重组酶的细胞且成功转化为DNA双链的AAV载体。CREATE技术通过将随机肽段插入到AAV9衣壳的3倍突起部位和在polyA结构中引入Cre重组可逆开关的方法生成AAV衣壳文库。将AAV衣壳文库注射能够组织特异性表达Cre的小鼠后，成功鉴定了可以特异性转导CNS 的 AAV-PHP.B[22]。

AAV衣壳蛋白库定向进化的路径尚未明确，通过体外/动物体内筛选出的病毒衣壳在人体内是否有效仍无法预测，而计算机分析则可以帮助人们理解改良AAV载体的特征。近年来，随着下一代测序、DNA条形码标记和人工智能学习等新技术手段的出现，如今研究者们可以系统地对Cap基因全部735个位点的突变体（约20万种）进行研究，从而更好地指导衣壳蛋白改造工程，确定适合改造的高变区域，加速靶向性AAV载体的发现[23]。有研究运用DNA条形码标记和高通量测序技术来追踪定向进化过程中AAV衣壳进化过程，从而帮助人们理解定向进化的机制，加速改良rAAV载体的鉴定[24]。通过对已知衣壳序列的系统进化分析和统计建模，可以预测AAV的进化中间体和祖先衣壳序列，发现衣壳蛋白上高度多样性和保守性区域，从而为衣壳蛋白的定向进化和理性设计提供参考[25]。

3 结语

体内基因疗法治疗模式十分广泛，包括蛋白替代疗法、基因编辑、基因沉默等，需要设计出多样化的rAAV载体满足不同的临床需求。尽管rAAV作为基因疗法载体在临床上已取得初步成功，但仍然面临着许多挑战，如在人体内的转导效率低，靶向特性欠佳，大规模生产成本高以及缺少可靠的评估AAV转导效率的动物模型等。对rAAV载体序列和衣壳蛋白的改造，可以赋予rAAV载体细胞特异性转导、高转导效率和转基因表达水平以及躲避宿主免疫反应等特性。然而，尽管已在体外或动物模型中开发多种AAV载体，但这些载体在人体内是否有效仍无法预测，只能通过开展多项临床试验来评估这些载体的安全性和有效性，选出最佳的候选载体。目前，对于腺相关病毒的开发仍处于起步阶段，大部分临床试验采用的仍是天然来源的AAV载体，未来将会有更多工程化rAAV载体进入临床试验阶段，也必将会有更多的新技术出现，如人源化小鼠和3D人类组织培养作为筛选和临床前疗效评估模型。基因疗法的一大缺点是治疗费用高昂，其中一个主要原因就是rAAV大规模生产难度高，因此未来对于rAAV大规模生产工艺的开发将是重点方向之一。