翟红梅， 张泽宇2， 杜天庆， 杨舒添， 高志强， 崔福柱

(1.山西农业大学农学院， 山西 太谷 030801； 2.山西应用科技学院， 山西 太原 030062)

硒在生物体中起着重要的作用，被称为“生命的火种”，硒在增强机体免疫、抗癌、预防心血管疾病、解毒等方面有显著作用[1-3]。而中国2/3的土壤处于缺硒状态，导致食物营养状况被制约[4]。植物作为人和动物摄入硒的重要环节，也是唯一的直接来源[5-6]。人体补充硒营养的根本途径就是提高农产品硒水平[7]。红芸豆是十分重要的蛋白来源，富含多种人体所需的氨基酸，籽粒营养丰富，兼有药用价值，深受国内外市场欢迎[8-9]。因此，通过施加硒肥提高红芸豆硒含量十分重要。

微肥常用的方法之一就是浸种，目前有诸多关于硒浸种对作物种子萌发方面的研究[10-13]。大量研究表明，硒浸种可以有效促进大豆、绿豆、豌豆等种子萌发，提高种子发芽率[14-16]，并且适当硒浓度可以有效提高种子萌发过程中SOD、SOD、PPO等氧化酶活性，此外，硒浸种还能促进种子萌发过程中可溶性糖、可溶性蛋白等营养物质的合成。而有关红芸豆硒浸种的研究寥寥无几。周大寨等在研究硒浸种对芸豆萌发的影响时发现，低质量的硒处理能够促进芸豆种子萌发，高质量的硒处理抑制芸豆种子萌发[17]。大部分有关硒浸种的研究采用无机硒处理，关于有机硒浸种的研究鲜有报道。因此，本试验通过比较2种硒源浸种处理下红芸豆种子萌发情况，各生理指标及硒含量的变化，探讨适宜硒源及最佳硒浸种浓度，为生产富硒红芸豆提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试芸豆材料为英国红芸豆，是山西境内种植的主要芸豆品种。该品种籽粒营养丰富，是出口创汇的优质品种。

1.2 试验设计

试验于2018年在山西农业大学栽培实验室进行。选取大小均匀，健康饱满的红芸豆种子，采用有机硒和无机硒2种硒肥浸种，2种硒源各设7个浓度梯度：0，7.5，15，22.5，30，37.5，45 mg·L-1(以纯硒计算)。3次重复，共42个处理。先用1%的氯化汞浸种消毒5 min，然后将消毒后的种子放入相应浓度的2种硒源中浸种6 h，随后放入消毒过的培养皿中，每个培养皿铺2层含饱和水分的滤纸，各均匀放入20粒红芸豆种子，腹沟向下，种胚朝上。在25 ℃下模拟黑白交替发芽，每天喷洒蒸馏水，使种子保持较湿润的状态，每天记录发芽种子数。

1.3 样品采集与测定

在芸豆发芽期间，第4天计算发芽势，第7天统计发芽率、发芽指数，随机测量5株幼苗的苗长、根长、称量单株幼苗鲜重、苗干重，取平均值，计算简化活力指数和抑制率，并测定相关生理指标。

生理指标测定[18]：过氧化物酶(POD)活性的测定采用愈创木酚法，超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用氮蓝四唑法，丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法。

DPPH自由基清除能力的测定[19]：利用DPPH溶液与上清液作用使DPPH紫色消退导致吸收光谱强度变化的原理，通过加入上清液前后吸光度的线性变化计算自由基清除率。

芸豆幼苗硒含量测定[20]：从每个处理中随机称取烘干后的幼苗，用粉碎机粉碎，采用 HNO3∶H2O2=6∶2 在微波消解仪中消解，利用ICP-MS(电感耦合等离子体-质谱法)测定硒含量。

发芽率(%)=(第7天发芽种子粒数/供试种子总粒数)×100% ；

发芽势(%)=(第4天发芽种子粒数/供试种子总粒数)×100% ；

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发芽指数=∑(t时间发数芽/相应发芽天数)；

抑制率(%)=[(对照-处理)/对照]×100%；

简化活力指数=第7天幼苗长×发芽率；

DPPH自由基清除率(%)=(1-As/A0)×100% (式中，As为样品吸光值，A0为对照吸光值)。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2010软件进行数据处理及绘图制表，使用SPSS 16.0分析软件的Duncan(新复极差)法(p<0.05)进行显著性检验。参考王艳青等[21]的方法计算各指标隶属函数值，并进行综合评价，计算公式：

U(ij)=(X(ij))-X(jmin))/(X(jmax)-X(jmin)) (1)

U(ij)=1-(X(ij)-X(jmin))/(X(jmax)-X(jmin)) (2)

式中，U(ij)为i浓度下j指标的隶属函数值，U(ij)∈[0,1]，X(ij)为i浓度下j指标的测定值，X(jmin)和X(jmax)分别为j指标的最小测定值和最大测定值；(1)式为正相关指标隶属函数值的计算公式，(2)式为负相关指标隶属函数值的计算公式。

2 结果与分析

2.1 2种硒源对红芸豆种子发芽的影响

从表1可看出，2种硒源对红芸豆种子的萌发有显著影响。随着有机硒浓度的增加，红芸豆种子的发芽率、发芽势以及活力指数均呈增高的趋势，均在硒浓度45 mg·L-1下显著高于对照(p<0.05)，而发芽指数在硒浓度45 mg·L-1下有下降的趋势，在硒浓度37.5 mg·L-1下达到最大，且显著高于对照(p<0.05)。此外，红芸豆种子有机硒浓度达到37.5 mg·L-1时第3天开始萌发，早于其余有机硒处理，说明一定浓度的有机硒可以促进红芸豆种子萌发，结果还发现，除发芽率外，其余各指标在有机硒浓度37.5～45 mg·L-1间无显著差异(p<0.05)。而随着无机硒浓度的增加，红芸豆种子的发芽势、发芽率、发芽指数及活力指数均呈先增高后降低的趋势，均在硒浓度30 mg·L-1处理下显著高于对照(p<0.05)。而在硒浓度37.5～45 mg·L-1下红芸豆种子发芽势、发芽率、发芽指数及活力指数有明显下降趋势，且红芸豆第5天时开始萌发，说明低浓度的无机硒可以促进红芸豆种子萌发，而高浓度的无机硒抑制红芸豆种子萌发。此外，无机硒和有机硒处理下红芸豆种子的发芽势、发芽率、发芽指数及活力指数最大值相比对照分别提高了12.1%、17.1%、53.8%、103.2%，14.6%、16.6%、49.1%、102.6%，且红芸豆种子在无机硒浓度达到15 mg·L-1时第3天开始萌发。

图1 2种硒源对红芸豆POD、SOD、MDA含量的影响

表1 2种硒源对红芸豆种子发芽的影响

处理浓度/(mg·L-1)发芽势/%发芽率/%发芽指数活力指数萌发天数ck79.6c80.8e20.4b1.15d47.580.4c82.2e20.7b1.28d415.082.6bc85.8d21.2b1.49cd4有机硒22.584.2b86.8cd21.6b1.82bc430.085.2b87.8c28.4a1.92abc337.588.6a90.0b31.1a2.11ab345.091.2a94.2a30.4a2.32a3ck79.6de80.8e20.4b1.15d47.581.0cd83.2d20.7b1.30d415.082.4bc85.8c27.5a1.61c3无机硒22.584.2b87.6b29.5a1.96b330.089.2a94.6a31.4a2.33a337.581.0cd84.6cd16.2b1.64c545.077.8e80.4e15.8b1.30d5

注：表中不同小写字母表示差异达显著水平(p<0.05)。

2.2 2种硒源对红芸豆种子萌发的抑制率

由表2可知，2种硒源对红芸豆种子生长有不同程度抑制作用，各硒浓度下红芸豆苗鲜重、苗干重及苗长的抑制率均为负值，各生长量随有机硒浓度增加抑制率降低，在45 mg·L-1处抑制率最低，而随无机硒浓度增加各生长量抑制率先降低后增加，在30 mg·L-1处抑制率最低，此时，红芸豆种子活力最大。当无机硒浓度大于30 mg·L-1时，红芸豆各生长量抑制率明显升高，发芽率在45 mg·L-1时抑制率为正值，说明红芸豆幼苗出现明显抑制生长情况。此外，还发现，除无机硒浓度7.5 mg·L-1、45 mg·L-1外，红芸豆各生长量抑制情况为：对苗干重的抑制率>对苗鲜重的抑制率>对苗长的抑制率。

表2 2种硒源对红芸豆种子萌发的抑制率

处理浓度/(mg·L-1)苗鲜重苗干重苗长发芽率ck0.00000.00000.00000.00007.5-0.0457-0.0425-0.0986-0.017315.0-0.1152-0.0324-0.2254-0.0619有机硒22.5-0.2194-0.0578-0.4789-0.074330.0-0.2571-0.0743-0.5352-0.086637.5-0.4685-0.0959-0.6479-0.113945.0-0.5260-0.1149-0.7465-0.16587.5-0.1435-0.0006-0.0986-0.029715.0-0.2885-0.0298-0.3239-0.0619无机硒22.5-0.3574-0.0406-0.5775-0.084230.0-0.4414-0.0648-0.7324-0.170837.5-0.2744-0.0279-0.3662-0.047045.0-0.1486-0.0152-0.14090.0050

2.3 不同硒源对红芸豆种子POD、SOD、MDA含量的影响

2.3.12种硒源对红芸豆POD活性的影响

从图1 A可以看出，2种硒源浸种下红芸豆种子萌发期POD活性较对照有明显变化，各硒浸种处理下红芸豆POD活性均显著高于对照(p<0.05)。红芸豆POD活性随有机硒浓度增加而增加，在45 mg·L-1下POD活性最大(为130.1 U·g-1)，相比对照提高了218.2%。 但在22.5～45 mg·L-1之间红芸豆POD活性无显著差异。而随着无机硒浓度增加，红芸豆POD活性呈先升高后降低的趋势，在30 mg·L-1下POD活性最大，为141.7 U·g-1，相比对照提高了246.4%。

2.3.22种硒源对红芸豆SOD活性的影响

由图1 B可以看出，2种硒源下红芸豆SOD活性变化趋势与POD活性变化趋势相似。在有机硒45 mg·L-1下红芸豆SOD活性最大(为219.1 U·g-1)，相比对照显著提高了107.9%(p<0.05)，同样发现在22.5～45 mg·L-1之间红芸豆SOD活性无显著差异。在无机硒处理下，红芸豆SOD活性在7.5～30 mg·L-1之间呈上升趋势，当硒浓度大于30 mg·L-1时SOD活性降低，此时酶活性被抑制，在30 mg·L-1处SOD活性最大(为218.1 U·g-1)，相比对照显著提高了107.0%(p<0.05)。

2.3.3不同硒源对红芸豆MDA含量的影响

从图1 C可以看出，2种硒源能够显著降低红芸豆MDA含量。在有机硒处理下，红芸豆MDA含量随硒浓度增加而降低，在45 mg·L-1时最低值为33.9 mmol·g-1，相比对照显著降低了61.2%(p<0.05)，但与37.5 mg·L-1下MDA含量无显著差异。在无机硒处理下，红芸豆MDA含量随硒浓度增加呈先降低后增加的趋势，在30 mg·L-1时最低值为36.4 mmol·g-1，相比对照显著降低了58.3%(p<0.05)。

2.4 2种硒源对红芸豆DPPH自由基清除率的影响

DPPH自由基主要应用于评价物质的抗氧化活性[22]。由图2可以看出，2种硒源都能有效提高红芸豆DPPH自由基清除率。在有机硒处理下，红芸豆DPPH自由基清除率随硒浓度增加而升高，在45 mg·L-1处达到最高为81.9%，此时红芸豆抗自由基能力最强。在无机硒处理下，红芸豆抗自由基能力随硒浓度增加先升高后降低，在30 mg·L-1处DPPH自由基清除率达到最高(为82.0%)，当硒浓度大于30 mg·L-1时，红芸豆抗自由基能力下降，说明高浓度无机硒抑制红芸豆抗自由基能力。

图2 2种硒源对红芸豆DPPH自由基清除率的影响

2.5 2种硒源对红芸豆硒含量的影响以及相关分析

由图3可以看出，2种硒源相比对照有效提高了红芸豆硒含量。红芸豆硒含量随硒浓度增加而增加，在45 mg·L-1处硒含量最高，有机硒处理下的最高硒含量为0.284 5 mg·kg-1，无机硒处理下的最高硒含量为0.319 2 mg·kg-1，分别比对照提高了17.5、19.7倍。从图4可以看出，2种硒源下的硒浓度与红芸豆硒含量关系呈二次回归(R2=0.972 9,R2=0.982 6)。

图3 2种硒源对红芸豆硒含量的影响

图4 不同硒源与红芸豆硒含量间线性关系

2.6 应用隶属函数法对2种硒源不同浓度下红芸豆各项指标的综合评价

由表3中红芸豆发芽指标(苗鲜重、苗干重、苗长、发芽率、发芽势、发芽指数、简化活力指数)隶属函数平均值以及生理指标(POD活性、SOD活性、MDA含量、DPPH自由基清除率)、硒含量隶属函数平均值可知，在有机硒45 mg·L-1下红芸豆各项指标隶属函数平均值最高(为0.995 2)，其次在无机硒30 mg·L-1下为0.967 6，因此综合评价下有机硒45 mg·L-1处理效果最好。

表3 2种硒源不同浸种浓度下红芸豆各指标隶属函数平均值

指标处理浓度 有机硒 无机晒 ck7.515.022.530.037.545.0ck7.515.022.530.037.545.0发芽指标0.00000.12850.25680.44060.60730.83760.99040.06840.19870.49780.69511.00000.36710.1279生理指标与硒含量0.00000.18730.48650.65200.75500.90181.00000.00000.24150.51060.80800.93520.85850.8011隶属函数平均值0.00000.15790.37160.54630.68110.86970.99520.03420.22010.50420.75150.96760.61280.4645

3 讨论与结论

本试验结果发现，2种硒源都能有效促进红芸豆种子萌发，提高POD、SOD活性，降低MDA含量，提高DPPH自由基清除率以及幼苗硒含量。有研究表明，低浓度无机硒浸种能够有效促进种子萌发，而高浓度无机硒抑制种子萌发[23-25]。本试验结果也发现，当无机硒浓度小于30 mg·L-1时能够有效提高红芸豆发芽率、发芽势、萌发指数等，而当浓度大于30 mg·L-1时红芸豆种子萌发被抑制。而周大寨等研究发现，硒浸种(浓度0～15 mg·L-1)可以促进芸豆种子萌发，硒浓度大于15 mg·L-1时抑制芸豆种子萌发[17]。芸豆的萌发情况与环境条件，品种等多种因素有关，对此结果差异需进一步试验。本试验还发现在有机硒45 mg·L-1下效果最好，但与37.5 mg·L-1下的红芸豆发芽情况相比没有显著差异。而在30～45 mg·L-1之间，红芸豆萌发的各生理指标无显著差异，因此，考虑资源浪费，建议有机硒浓度在30～37.5 mg·L-1范围为宜。已有研究发现，硒能够有效提高植物体内POD、SOD等抗氧化酶活性，清除植物体内自由基，提高抗氧化能力[26-28]，本试验结果也有同样发现。这是由于硒是GSH-Px(谷胱甘肽过氧化物酶)的组成成分，而GSH可以清除自由基以及过氧化脂质，同时植物体能够将无机硒转化为人体能够吸收利用的有机硒，有机硒又可以促进新陈代谢，增加抗氧化能力[29-30]。本试验还发现，2种硒源显著提高了红芸豆幼苗中硒含量，且硒含量与硒浸种浓度呈二次回归线性关系，2种硒源均在45 mg·L-1处硒含量最高，有机硒处理下最高硒含量为0.284 5 mg·kg-1，无机硒处理下的最高硒含量为0.319 2 mg·kg-1，参考国家粮食富硒含量标准，豆类作物，富硒豆类硒含量标准为0.02～0.30 mg·kg-1[31]，而本试验中无机硒37.5～45.0 mg·L-1下幼苗硒含量均超过了籽粒标准含量，但目前未指出关于芸豆幼苗硒含量标准，因此，还需进一步研究硒浸种对红芸豆各个生育时期及籽粒硒含量、产量影响，确定安全硒浸种浓度。综上所述，尽管无机硒效果优于有机硒，见效快，但无机硒毒性大，摄入过量会引起中毒现象，且目前无机硒肥不能广泛应用市场，没有特定限量标准。而有机硒一般以硒蛋氨酸形式存在，参与人体代谢以及蛋白的合成，容易被人体吸收利用，安全性高，不易发生中毒。在关于成人对无机硒和有机硒日摄入量的研究中发现，当人体摄入一定量的有机硒与无机硒，人体每毫升血液中有机硒上升浓度是无机硒的2倍，人体对有机硒的吸收是无机硒的20倍[32-33]。因此，开发出安全高效，能够广泛应用于市场的有机硒肥对生产富硒作物及人体健康有重要意义。

本试验结果表明，2种硒源浸种能够有效促进红芸豆种子萌发。无机硒在0～30 mg·L-1，有机硒在0～45 mg·L-1处可以有效促进红芸豆种子发芽，提高POD、SOD活性、DPPH自由基清除率，降低MDA含量。2种硒源浸种能够显著提高红芸豆幼苗硒含量，且与硒浓度呈二次回归关系，显著相关，通过各项指标隶属函数综合评价得出，在有机硒浸种浓度45 mg·L-1处理下效果最佳。