李悦明，李 霞，徐洪清2，徐建春，逄瑞莲3，张云鹏，徐炳政

(1.青岛琅琊台集团股份有限公司，山东 青岛 266400；2.青岛西海岸新区农业农村局，山东 青岛 266400；3.青岛西海岸新区市场监督管理局，山东 青岛 266400)

白酒糟是白酒生产过程中产生的废渣或副产物，其处理利用已经成为行业工作的重点。据统计，我国酒糟年产2 700万吨，如果处理不及时，便会造成环境污染[1-2]，白酒糟中含有一定量的蛋白质、还原糖、维生素及淀粉等成分，如能加以利用，则是一种很好的原料[3-4]。裂殖壶藻是一种单细胞海洋真菌[5]，裂殖壶藻粉是裂殖壶藻经喷雾干燥后的一种饵料资源，其细胞内含有大量的有活性物质，如油脂DHA、蛋白等，保证饲料中DHA含量可以提高水产动物的忍耐力，提高存活率促进其生长发育，改善免疫作用[6-8]。两者都是优良的饲料原料，但是蛋白质量分数相对偏低，本试验通过混合两种发酵原料，经微生物作用后，提高原料的蛋白质质量分数，同时改变传统酒糟发酵无DHA的特点，改善饲料产品品质。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

黑曲霉菌种、产朊假丝酵母菌种(实验室保存)、白酒糟、裂殖壶藻粉，青岛琅琊台集团；自动定氮仪KDN-103F，上海纤检仪器有限公司；电子天平CP213，奥豪斯仪器有限公司。

1.2 粗蛋白的测定

利用自动定氮仪KDN-103F，采用凯氏定氮法，测定粗蛋白含量[9]。

1.3 硝酸铵的定性检测

加6～8滴上清液到点滴板上，然后加2～3滴二苯胺，观察颜色变化结果，阳性反应的结果：在点滴板中间是深蓝色，最低检测线是0.05%[10]。

1.4 微生物混合原料发酵试验

将白酒糟烘干粉碎后和裂殖壶藻粉按m(白酒糟)∶m(裂殖壶藻)=1∶1.5混合后制备发酵原料，将此原料进行不同的发酵条件的蛋白质量分数实验。

1.4.1 微生物不同混合比实验

在其他发酵条件相同的条件下，将黑曲霉和产朊假丝酵母分别按m(黑曲霉)∶m(产朊假丝酵母)=0.6∶1，0.8∶1，1∶1，1∶1.2的比例在添加总量相同的条件下测定产物粗蛋白质量分数。

1.4.2 微生物接种量试验

在其他发酵条件相同的条件下，分别按接种量2%，3%，4%，5%，6%的比例添加混合菌种测定产物粗蛋白质量分数。

1.4.3 硝酸铵添加量试验

在其他发酵条件相同的条件下，将硝酸铵分别按质量分数0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%添加到发酵原料中后测定产物粗蛋白质量分数。

1.4.4 培养基水分试验

在其他发酵条件相同的条件下，将水分质量分数分别调整到34%，36%，38%，40%，42%，测定产物粗蛋白质量分数。

1.4.5 pH试验

在其他发酵条件相同的条件下，将pH分别调整到4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，测定产物粗蛋白质量分数。

1.4.6 麸皮添加量试验

在其他发酵条件相同的条件下，将麸皮分别按质量比5%，10%，15%，20%，25%的比例添加到发酵原料中发酵后测定产物粗蛋白质量分数。

1.4.7 温度作用试验

在其他发酵条件相同的条件下，将混合好的发酵原料分别在26，28，30，32，34 ℃发酵后测定粗蛋白质量分数。

1.4.8 发酵作用时间实验

在其他发酵条件相同的条件下，分别控制发酵时间在48，60，72，84 h测定发酵蛋白质量分数。

1.4.9 最优条件发酵实验

取上述单因素实验的最优条件，进行发酵实验，对比发酵前后粗蛋白质量分数变化。

2 结果分析

2.1 微生物质量比对粗蛋白质量分数的影响

菌种质量比对粗蛋白质量分数的影响如图1所示。

图1 菌种质量比对粗蛋白质量分数的影响Fig.1 Effect of strain ration on the crude protein mass fraction

由图1可知：不同的菌种比例对粗蛋白的影响较大，原因与黑曲霉和产朊假丝酵母所分泌的酶系或菌体本身的蛋白有关，黑曲霉能分泌蛋白酶和纤维素酶，产朊假丝酵母含有较高的蛋白[11]，菌种之间进行合理配比能够提高发酵原料的蛋白质量分数，两者按1∶1进行配比发酵粗蛋白质量分数最高。

2.2 接种量对粗蛋白质量分数的影响

接种量对粗蛋白质量分数的影响如图2所示。

图2 接种量对粗蛋白质量分数的影响Fig.2 Effect of inoculation amount on crude protein mass fraction

由图2可知：当接种量在5%时，发酵产品的粗蛋白质量分数最高，过低菌株增长缓慢，周期长，过高则使菌种生长过快，不利于粗蛋白积累，而且菌种的制备也较繁琐，增加接种量会造成成本增加，因此本实验的接种量控制在5%。

2.3 硝酸铵添加量对粗蛋白的影响

硝酸铵添加量对粗蛋白质量分数的影响如图3所示。

图3 硝酸铵添加量对粗蛋白质量分数的影响Fig.3 Effect of ammonium nitrate on the crude protein mass fraction

由图3可知：随着硝酸铵用量的添加，粗蛋白呈递增趋势，但是在硝酸铵添加量在2%时，经硝酸盐定性检测，在点滴板中间已开始出现蓝色颜色反应，代表硝酸铵添加过量，而当硝酸铵添加质量分数在1.5%时，粗蛋白质量分数与2%时差别不大，且经硝酸铵定性检测，无颜色反应，因此选择硝酸铵添加量为1.5%。

2.4 培养基水分对粗蛋白质量分数的影响

水分质量分数对粗蛋白质量分数的影响如图4所示。

图4 水分质量分数对粗蛋白质量分数的影响Fig.4 Effect of water content on the crude protein mass fraction

由图4可知：控制培养基含水量在42%时，粗蛋白质量分数最高。在培养基含水量较低时，不适宜菌体生长，粗蛋白质量分数较低。当培养基水分质量分数较高时，整个发酵基质呈现黏着状态，阻碍菌体的生长。控制培养基水分对微生物来说是至关重要的，本实验选择水分质量分数控制在42%。

2.5 pH对粗蛋白质量分数的影响

pH对粗蛋白的影响如图5所示。

图5 pH值对粗蛋白质量分数的影响Fig.5 Effect of pH on the crude protein mass fraction

由图5可知：发酵培养基pH在6.0～6.5时，粗蛋白质量分数较高。菌种生长都有最适合的pH，而且随着发酵的进行，体系的pH值会发生变化，因此需要调整培养基的pH，使菌体达到较为适宜的发酵。

2.6 麸皮添加量对粗蛋白质量分数的影响

麸皮添加质量分数对粗蛋白质量分数的影响如图6所示。

图6 麸皮添加量对粗蛋白质量分数的影响Fig.6 Effect of bran amount on the crude protein mass fraction

由图6可知：麸皮添加质量分数在15%时，原料发酵后粗蛋白质量分数最高，麸皮含量过高或过低都会影响发酵产物中粗蛋白的质量分数，这是因为麸皮中含有较多的碳源能促进微生物的生长，同时适量的麸皮的添加可以改善白酒糟的通气性以保障微生物生长所需要的氧气[12-13]，但是过量的麸皮会抑制微生物的生长，所以选择麸皮质量分数为15%时对发酵蛋白质的提高效果最明显。

2.7 温度对粗蛋白质量分数的影响

温度对粗蛋白质量分数的影响如图7所示。

图7 温度对粗蛋白质量分数的影响Fig.7 Effect of temperature on the crude protein mass fraction

由图7可知：在30 ℃条件下，粗蛋白质量分数最高。当发酵温度较低时，微生物没有达到最适合的生长条件，生长迟缓，而当发酵温度过高时，则可能导致微生物死亡或者微生物生长过快，到达峰值后迅速进入衰亡，因此粗蛋白质量分数较低。

2.8 发酵时间对粗蛋白质量分数的影响

发酵时间对粗蛋白质量分数的影响如图8所示。

图8 发酵时间对粗蛋白质量分数的影响Fig.8 Effect of fermentation time on the crude protein mass fraction

由图8可知：随着发酵时间延长，粗蛋白质量分数逐渐提高。在前期菌种需要一定的生长停滞期，在72 h随着菌丝生长及各种酶质量分数达到最高，蛋白质量分数达到最高，时间再延长，粗蛋白质量分数已提高不大，因此选择发酵时间72 h 。

2.9 最优条件下粗蛋白质量分数变化

发酵前后粗蛋白质量分数分别为21.46%和27.63%。在控制以上单因素最优条件下进行发酵，此时微生物生长繁殖最为旺盛，代谢产物积累量最大，原料的粗蛋白质量分数提高最多。

3 结 论

经黑曲霉和产朊假丝酵母发酵白酒糟和裂殖壶藻粉后可以改善产品质量。发酵控制条件为在白酒糟和裂殖壶藻粉按m(白酒糟)∶m(裂殖壶藻)=1∶1.5混合后，微生物按m(黑曲霉)∶m(产朊假丝酵母)=1∶1，接种量5%，硝酸铵添加质量分数1.5%，水分质量分数42%，pH 6.0～6.5，30 ℃，麸皮添加质量分数15%，发酵时间72 h的条件下组合进行发酵实验，此时粗蛋白提高率为28.75%。