马 玉，张一杨，贾云鹏，徐 杰，张 咪，王 雪，吴冬雪，冯福民,2

结核病是我国较为严重的传染病之一，一线抗结核药物包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺等[1]，有研究[2]表明单用异烟肼对肝脏具有明显毒副作用。单用利福平可加重肝细胞损伤，其肝毒性主要来自胆汁淤积[2]。临床上，通常基于异烟肼，采用二联、三联、四联的方式治疗。目前，药物性肝损伤机制仍不明确，有研究[3]指出，人体在代谢抗结核药物过程中引起的炎症反应在肝损伤的发生过程中起重要作用，并可能成为其防治靶点。而沉默信息调节因子1(silent information adjustment factor 1，SIRT1)具有抗炎、抗氧化、抗衰老等作用[4]，其可对NF-κB进行去乙酰基作用，进而在氧化应激、基因转录、能量代谢等方面发挥重要生物学功能[5]。故推测在抗结核药物引起的肝脏炎性损伤中，SIRT1通过调控NF-κB通路发挥其抗炎作用。本研究通过模拟临床治疗结核病的方案，用三药联合刺激人正常肝细胞(HL-7702)，观察肝细胞损伤过程中SIRT1的变化情况，并用SIRT1激动剂和抑制剂干扰其表达，观察其对NF-κB信号通路及其下游炎症因子的影响，从而探究SIRT1在肝脏炎性损伤中的作用，为抗结核药物性肝损伤的预防提供一定线索。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器肝细胞株HL-7702(购自上海中科院细胞所)；异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(日本TCI公司，批号：W3OKK-MI)；SIRT1激动剂SRT1720和抑制剂EX527(美国Selleck公司，批号：S112906)；逆转录试剂盒、PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司，批号：AK4601)；总RNA抽提试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司，批号：0020161010)；ALT、AST试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20170301)；TNF-a ELISA试剂盒和IL-6 ELISA试剂盒(杭州联科生物技术有限公司，批号：201612)；CA 94089型连续光谱酶标仪(美国Molecular Devices公司)；C1000 PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司，型号：C1000TM Thermal Cycler)；实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司，型号：5404CH010973)。

1.2细胞培养与分组[6]细胞在含90% RPMI 1640、10%胎牛血清、1%双抗混合培养基中，37 ℃、5%CO2培养箱培养[7]。实验分为：C组(RPMI 1640培养基)、I+R+P组(含120 μg/ml异烟肼、240 μg/ml利福平、600 μg/ml吡嗪酰胺的RPMI 1640培养基)、I+R+P+S组(含120 μg/ml异烟肼、240 μg/ml利福平、600 μg/ml吡嗪酰胺和1 μmol/L SIRT1激动剂SRT1720的RPMI 1640培养基)、S组(含有1 μmol/L SIRT1激动剂SRT1720的RPMI 1640培养基)、I+R+P+E组(含120 μg/ml异烟肼、240 μg/ml利福平、600 μg/ml吡嗪酰胺和1 μmol/L SIRT1抑制剂EX527的RPMI 1640培养基)、E组(含有1 μmol/L SIRT1抑制剂EX527的RPMI 1640培养基)。

1.3 HE染色检测细胞形态学变化[7]加药培养48 h后，收集各组细胞后用95%乙醇固定，PBS缓冲液洗涤。苏木精染色，1%盐酸酒精分色，伊红染色，在95%乙醇中调色。采用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。

1.4 细胞上清液中检测ALT、AST水平[7]收集各组细胞上清液，在96孔板中分别设置标准孔和检测孔，将ALT、AST基质液加入各孔后，再将各组细胞上清液加入检测孔，37 ℃温育30 min，各孔加2，4-二硝基肼，混匀，37 ℃温育20 min后加NaOH于各孔，混匀，室温静置，酶标仪检测OD值。

1.5 RT-PCR法检测各组细胞中SIRT1、NF-κB p65、TNF-α、IL-6 mRNA的含量变化[7]收集各组细胞，TRIzol法提取总RNA，检测其浓度及纯度, OD260/OD280在1.8～2.0范围内用于逆转录反应：PrimeScript®RT Master Mix(for real time)2 μl，总RNA量为500 ng，RNase Free dH2O补足至10 μl，在35 ℃反应10 min，80 ℃进行5 s，取出反应液即为cDNA。RT-PCR检测mRNA表达水平，反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ10 μl、上下游引物各0.8 μl、ROX 0.4 μl、RT反应液2 μl、RNase Free dH2O补足至20 μl。反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性60 s, 60 ℃退火30 s，共40个循环。采用2-ΔΔct计算结果。引物序列见表1。

1.6 Western blot法检测SIRT1、NF-κB p65蛋白的含量[8]收集各组细胞，吸出细胞上清液，加入预冷的RIPA裂解液，并将苯甲基磺酰氟(PMSF)按照100:1加到裂解液中，摇床摇约5 min后，将细胞刮进1.5 ml EP管内，离心10 min，取上清液进一步实验，全程冰上操作，测定蛋白浓度，配制SDS-PAGE分离胶，各组取等量蛋白提取液，上样后进行垂直电泳，电泳完成后湿转至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭2.5 h，加入一抗过夜，洗涤后，加入二抗孵育2.5 h，置于凝胶成像系统显像，蛋白表达量为目标蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的相对比值。

1.7 ELISA法检测各组细胞中IL-6、TNF-α蛋白的含量[9]试剂盒室温平衡20 min后取出板条，设置标准孔和样本孔，标准孔加不同浓度标准品各50 μl，样本孔加细胞上清液10 μl同时加入40 μl样本稀释液，各孔加入辣根过氧化物酶(HRP)，封板膜封住，37 ℃温育后，洗板5次，每孔加入显色剂A、B，37 ℃温育后，加终止液，酶标仪检测OD值，最后通过标准曲线方程计算蛋白含量。

1.8 统计学处理[8]采用SPSS 23.0进行统计分析。计量资料以进行统计描述，检测方差齐性，方差齐时，组间比较采用单因素方差进行分析，两两比较采用SNK-q检验[9]，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列

2 结果

2.1 各组细胞形态学变化HE染色结果可见，C组、S组和E组的肝细胞形态饱满，核大而圆，呈梭形，细胞生长密集，提示激动剂和抑制剂不影响肝细胞的正常生长。I+R+P组可发现肝细胞核固缩且细胞凋亡明显，加入SIRT1激动剂后的I+R+P+S组细胞凋亡水平降低，加入SIRT1抑制剂后的I+R+P+E组可见细胞凋亡水平升高，提示SIRT1激动剂的联用可部分减轻抗结核药物所致肝细胞损伤，而SIRT1抑制剂的联用可加重由一线抗结核药物联用引起的肝细胞损伤，见图1。

图1 不同组别肝细胞形态学变化 HE×100A：C组；B：S组；C：E组；D：I+R+P组；E：I+R+P+S组；F：I+R+P+E组

2.2 各组细胞上清液中的ALT、AST含量结果显示：与C组相比，I+R+P组ALT、AST水平明显升高(P<0.01)，提示抗结核药物可诱导肝细胞损伤；S组、E组与C组相比均无统计学意义，提示SIRT1激动剂和抑制剂对肝细胞无毒副作用；加入SIRT1激动剂后，ALT、AST含量降低(P<0.01)，提示抗结核药物组中SIRT1激动剂的加入可减缓肝损伤程度；加入SIRT1抑制剂后，则加重了肝损伤的程度，此结果均与上述HE染色结果一致。见表2。

表2 各组细胞上清液中ALT和AST含量的变化

与C组比较：**P<0.01; 与I+R+P组比较：##P<0.01

2.3 各组细胞SIRT1、NF-κB p65、TNF-α、IL-6的mRNA及蛋白表达水平I+R+P组SIRT1的mRNA和蛋白表达量均低于C组，NF-κB p65、IL-6及TNF-α的mRNA和蛋白表达量均升高(P<0.01)，提示抗结核药物可能刺激了正常肝细胞发生炎症反应。S组、E组与C组相比，IL-6、TNF-α表达差异无统计学意义，提示SIRT1激动剂和抑制剂对细胞无明显毒副作用，与上述结果一致。与I+R+P组相比，加入SIRT1激动剂后，NF-κB p65的mRNA及蛋白表达下降，进而IL-6、TNF-α的mRNA及蛋白表达也下降(P<0.01)，提示SIRT1的激活可以通过降低NF-κB p65的表达进而减轻抗结核药物引起的肝细胞炎症性反应。见图2和表3、4。

3 讨论

目前，抗结核药物的使用有效抑制了结核的传播，但其副反应却不容小觑，其预防和治疗的手段仍然有限，需要更多的研究阐明其机制。临床上治疗结核病的用药原则是，长期四种一线抗结核药物(异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇)联合应用，这大大增加肝损伤的发生率，且多药联合应用使得肝损伤的发生机制比单独用药的更加复杂，成为抗结核治疗的难点问题。目前关于抗结核药物性肝损伤的发生机制研究中主要是针对一种抗结核药物进行阐述，在多药联合肝细胞模型中探究肝损伤发生机制尚未见报道。因此，本研究的特色之一就是建立异烟肼、利福平、吡嗪酰胺多药联合作用的肝细胞模型(因乙胺丁醇已被证明无肝毒性，故未加入模型中)，结果发现，抗结核药物的联用导致肝细胞发生核固缩，细胞凋亡率大幅增加，细胞上清液中ALT、AST水平也明显升高，说明一线抗结核药物联用使肝细胞发生了一定程度的损伤。

图2 各组细胞SIRT1、NF-κB p65 蛋白表达变化

与C组比较：**P<0.01; 与I+R+P组比较：##P<0.01

表3 各组细胞相关指标mRNA的变化

与C组比较：**P<0.01; 与I+R+P组比较：##P<0.01

表4 各组细胞IL-6、TNF-α蛋白表达变化

与C组比较：**P<0.01；与I+R+P组比较：##P<0.01

炎症反应是众多疾病的发病基础，其在肝脏疾病中尤为常见。研究[3]表明，抗结核药物代谢引起的炎症反应在肝损伤的发生过程中起重要作用，可能成为其防治靶点。课题组前期研究[10]表明，随着给药时间的延长，大鼠肝细胞损伤逐渐加重，由少量炎症细胞发展为大量聚集，提示抗结核药物可能引起肝细胞发生炎性损伤。TNF-α作为促炎因子可促进T细胞产生大量炎症因子，而IL-6又可直接参与炎症反应和损伤过程。在本研究中，IL-6及TNF-α的mRNA及蛋白水平在I+R+P组中均呈高表达，而SIRT1的mRNA及蛋白表达均减少，提示I+R+P组肝细胞发生了炎症损伤且SIRT1可能参与其中。

SIRT1作为去乙酰化酶，是一种多功能蛋白质[11]，NF-κB作为重要的炎症调节因子，是细胞中多个信号通路的聚集点，并且其高表达与肝脏疾病密切相关[12]。有研究[13]表明，SIRT1通过抑制NF-κB信号通路从而抑制炎症的发生。还有研究[14]显示，SIRT1可抑制肾髓质集合管细胞中NF-κB的转录。本研究结果发现，I+R+P组加入SIRT1激动剂后，降低了抗结核药物诱导的NF-κB p65表达进而使得细胞炎症损伤程度减轻，相反，加入SIRT1抑制剂后，细胞炎症损伤加重，提示激活SIRT1对药物性肝损伤具有保护作用且与前人研究[13-14]结果相同。

目前，SIRT1在药物性肝损伤中的机制尚不明确，有研究[15]表明，NF-κB p65可随上游刺激物的改变而产生不同的修饰作用，进而发挥其功能，其中，NF-κB p65的乙酰化修饰是其重要的修饰之一，SIRT1可通过去乙酰化作用使得肠系膜细胞中的NF-κB灭活。因此，抗结核药物致人肝细胞炎性损伤的机制可能为，SIRT1作用于NF-κB p65，使其发生去乙酰化，减少NF-κB与炎症因子的结合，进而减轻了细胞炎症损伤。

综上，SIRT1可能参与抗结核药物所致的肝细胞炎症损伤过程。该研究通过模拟临床用药以及一系列实验推测SIRT1与抗结核药物致人正常肝细胞炎症损伤的关系，但由于细胞株单一，不能证明此推测的普遍性，应进一步选择多种细胞株进行验证，此外，课题组将继续在动物、细胞以及临床研究等方面深入探究SIRT1在抗结核药物所致肝细胞炎性损伤中的机制，为临床上预防和保肝治疗提供依据。