罗文捷，张启芳，孟云超，赵 磊，唐澄海，张 晶，王柏涛，唐光耀

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)病程迁延、难以治愈，众多学者认为肠道持续反复感染、肠黏膜屏障功能障碍、肠黏膜免疫调节失衡、遗传和环境等多种因素共同参与了疾病的发生发展[1-3]。在UC的模型中，肠道呈高通透性、黏膜组织损伤和破坏，导致肠腔内的细菌、毒素及食物抗原等直接侵入黏膜的免疫系统引起炎症反应。因此，修复受损肠黏膜、维持肠黏膜的正常屏障功能在UC的治疗中尤其关键[4]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化潜能，能帮助组织和细胞修复、增殖，并能通过诱导和刺激内源性祖细胞来改善肠黏膜损伤，降低肠道通透性及绒毛破坏，调节肠道免疫系统，从而促进黏膜屏障功能的恢复[5-7]。研究[8]表明，BMSCs能通过促进炎症所致损伤组织的再生及修复起到治疗作用，Chen et al[6]也证实了注射的BMSCs会定植到受损结肠,并促进肠上皮细胞增殖和肠干细胞分化；但BMSCs对UC治疗的具体机制仍有待明确。

1 材料与方法

1.1 实验材料SPF级3周龄BALB/C雄性小鼠4只，购自上海斯莱克公司，清洁级实验室饲养，温度(20±4)℃，湿度45%～60%，通风良好，光照随昼夜浮动，颈离断处死后，在无菌条件下分离股骨并分离提取BMSCs，进行传代培养以备实验使用；SPF级6～7周龄BALB/C雌性小鼠75只，体质量19～21 g，购买公司及饲养条件同上；CD29、CD45、CD90抗体均购自美国Biolegend公司；葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS)购自上海翊圣生物有限公司；兔抗间质表皮转化因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor, c-Met)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)均购自英国Abcam公司；肝细胞生长因子(hepatoc yte growth factor，HGF)、肝细胞生长因子激活因子(hepatocyte growth factor activator，HGFA)ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；成骨诱导试剂盒(Von Kossa Kit)购自赛业(广州)生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1BMSCs的培养分离与鉴定 3周龄大小 BALB/C 雄性小鼠，颈离断处死，无菌条件下分离股骨，用5 ml注射器抽吸低糖培养基(L-DMEM)轻轻冲出骨髓直至髓腔变白，将冲洗液移入10 ml的无菌离心管中，混匀、离心、弃去上清液，然后用含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM重悬细胞，并接种于无菌塑料培养瓶中，置于 37 ℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中常规培养；于24 h细胞贴壁后首次更换培养液，往后每2～3 d更换培养液1次；待细胞生长至约瓶底体积80%时，用含0.25%的胰蛋白酶消化细胞，并按1 ∶2的比例进行细胞传代。利用BMSCs与其他细胞的贴壁差异性严格控制传代时胰酶的量和消化时间，取形态均一、活性良好的第 3～4 代细胞用于实验。根据国际细胞治疗协会2006年制定的多功能间充质干细胞的基本定义对培养细胞进行鉴定，流式细胞仪检测细胞表面抗原 CD29、CD45、CD90的表达情况；将BMSCs用抗坏血酸/β-甘油磷酸钠分化培养，3周后Von kossa Kit检测成骨情况，油红O检测地塞米松诱导的成脂情况；验证干细胞多向分化潜能。

1.2.2实验性结肠炎动物模型建立 实验小鼠随机分为3组：正常对照组、实验对照组(DSS+PBS组)、实验组(DSS+BMSCs组)，每组25只，正常对照组正常饮水，其余2组每天饮用4%的DSS(分子量 36 000～50 000)水溶液，共3周，实验对照组及实验组分别用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)、BMSCs进行干预治疗。实验期间每天观察小鼠的一般情况，每天定时称体质量1次，记录排便情况，进行大便潜血检查，根据小鼠疾病活动度指数(disease activity idex，DAI)评分，评估疾病的变化。

1.2.3标本收集与处理 造模后第8天，实验组小鼠经尾静脉注0.3 ml的BMSCs悬液(含1×106细胞)，其余两组则注射不含BMSCs的PBS 0.3 ml作为对照。分别于移植治疗后第2、5、9、12、16 天脱颈处死各组5只小鼠，取距离肛门8 cm处的2 cm长标本，12%中性甲醛固定，部分大肠标本-80 ℃保存。固定后的结肠标本常规脱水、石蜡包埋，制作5 μm厚连续切片，HE染色，于光学显微镜下观察全部切片组织病理学改变，并从炎症程度、炎症范围、隐窝损伤及损伤范围4个方面对结肠的炎症活动情况进行评分。免疫组化染色镜下观察c-Met、EGFR、PCNA的表达水平，一抗稀释浓度依次为1 ∶150、1 ∶100、1 ∶500。按ELISA试剂盒操作步骤完成结肠组织匀浆中HGF、HGFA的检测。

2 结果

2.1 BMSCs的鉴定镜下观察BMSCs贴壁生长，呈梭形、漩涡状，流式细胞仪检测BMSCs的表面抗原CD29、CD45、CD90的表达情况，结果为CD29(+)，CD45(-)，CD90(+)，并成功诱导分化为骨细胞、脂肪细胞，说明BMSCs的分离提取成功。见图1。

图1 BMSCs的分离培养与鉴定

A：BMSCs的光镜下表现 ×100；B、C：流式细胞仪检测表面抗原；D：BMSCs成骨诱导 ×200；E：BMSCs成脂诱导 ×200

表1 小鼠DAI评分

与正常对照组比较：*P<0.05；与实验对照组比较：#P<0.05

表2 小鼠结肠黏膜组织学评分

与正常对照组比较：*P<0.05；与实验对照组比较：#P<0.05

2.2 小鼠的一般情况及DAI评分在正常对照组中，小鼠皮毛有光泽、顺滑，反应灵敏，活动度好，无体质量减轻，粪便成正常条形；实验对照组小鼠毛色混杂、缺少光泽，反应迟滞，活动度明显减低，出现拱背、扎堆等表现，体质量下降，粪便稀糊状、水样，给药第5天开始有大便带血或血便，且随造模时间延长，体质量下降及血便情况更加明显；实验组小鼠毛色不如正常对照组有光泽，略显混杂，小鼠活动度基本正常，部分小鼠出现轻度体质量减轻或便中带血表现，但均不如实验对照组严重。

BMSCs干预治疗和治疗天数的交互作用对小鼠DAI评分的影响有统计学意义(F=4.588，P=0.023)。BMSCs注射后第2、5天，实验组和实验对照组小鼠DAI评分明显高于正常对照组(P<0.05)，且实验对照组小鼠DAI评分高于实验组(P>0.05)；BMSCs注射后第9、12天，实验组小鼠DAI评分均明显低于实验对照组，且差异有统计学意义(F=20.0，P=0.011；F=23.143，P=0.009)。在实验对照组和实验组中，对于不同时间点，小鼠DAI评分间的差异没有统计学意义，P值分别为0.426、0.368。干预后第16天，实验对照组部分小鼠出现严重血便、甚至死亡，故未进行评分比较。见表1。

2.3 小鼠肠上皮组织学变化在正常对照组中，小鼠结肠上皮细胞染色均匀，排列整齐，无明显黏膜层、黏膜下层结构破坏表现，腺体排列规则，隐窝形态正常，未见炎性浸润；实验对照组小鼠结肠黏膜上皮结构破坏明显，腺体及隐窝结构随实验时间延长而逐渐破坏，于实验后期可出现上皮严重坏死、缺损、断裂表现，甚至失去正常腺体、隐窝结构，可见大量炎症细胞浸润黏膜固有层及黏膜下层，严重者可累及全层；实验组小鼠结肠黏膜上皮结构尚规整，无明显断裂、缺损表现，黏膜固有层腺体、隐窝结构基本正常，可见少量炎症细胞浸润黏膜固有层，但未及黏膜下层，炎症细胞数量及浸润深度均不及实验对照组。

BMSCs干预治疗和治疗天数的交互作用对小鼠结肠黏膜组织学评分的影响有统计学意义(F=13.711，P<0.001)。实验对照组及实验组分数均明显高于正常对照组(P<0.05)，BMSCs干预后第2、5天，实验对照组与实验组小鼠结肠黏膜组织学评分差异均无统计学意义(P>0.05)，但BMSCs干预后第9、12天，实验对照组小鼠结肠黏膜组织明显破坏，组织学评分显著高于实验组，差异均有统计学意义(F=36.0，P=0.004；F=240.286，P<0.001)。在实验组中，不同时间点小鼠结肠黏膜组织学评分的差异无统计学意义，P=0.108；而在实验对照组中，不同时间点小鼠结肠黏膜组织学评分的差异有统计学意义(F=24.468，P<0.001)。干预后第16天，实验对照组小鼠结肠组织几乎不见正常结构，未进行评分。见表2、图2。

2.4 c-Met、EGFR、PCNA在小鼠结肠黏膜组织中的表达c-Met、EGFR主要表达于小鼠结肠上皮细胞胞质中，结果显示，实验对照组小鼠结肠上皮细胞中c-Met、EGFR表达较正常对照组明显减少，且随造模时间延长，减少趋势越明显，干预治疗后第12天及以后，小鼠结肠正常黏膜结构明显破坏，上皮层破损、断裂，几乎不见正常腺体、隐窝结构，c-Met、EGFR几乎不表达；但BMSCs干预治疗后小鼠结肠上皮细胞中c-Met、EGFR的表达与正常对照组表达差异不大。PCNA主要表达于细胞核，是反映细胞核增殖状态的良好指标，实验对照组中PCNA表达显著低于正常对照组和实验组，实验组较正常对照组的表达略有减少或无明显差别。见图3。

图2 小鼠结肠组织病理切片 HE×200 A、D、G：分别为第5、9、12天正常对照组；B、E、H：分别为第5、9、12天实验对照组；C、F、I：分别为第5、9、12天实验组

图3 小鼠结肠黏膜组织c-Met、EGFR、PCNA的表达 ×400 A-C、D-F、G-I分别为第12天小鼠结肠黏膜组织c-Met、EGFR、PCNA的表达；A、D、G：正常对照组；B、E、H：实验对照组；C、F、I：实验组

2.5 结肠组织HGF、HGFA的表达情况实验对照组HGF的表达量于干预后第2天达峰值，高于其余2组，之后其表达急剧下降，于第9天达最低峰，且除第2天外，其表达量均明显低于正常对照组(P<0.05)；HGF在实验组的表达为先下降后上升，并于BMSCs干预治疗第9天下降到最低值，干细胞注射后第5、12及16天，实验组HGF表达量明显高于实验对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。实验对照组HGFA的表达量先下降后上升,第9天达最低峰，除第5天、第9天，其余时间点与正常对照组的差异无统计学意义(P>0.05)，而实验组HGFA的表达随给药时间基本呈上升趋势，第2、5、12天表达明显低于实验对照组(P<0.05)，与HGF表达趋势不一致。见图4。

图4 结肠组织HGF、HGFA的ELISA结果

A：小鼠结肠组织中HGF的表达情况；B：小鼠结肠中HGFA的表达情况；与正常对照组比较：*P<0.05；与实验对照组比较：#P<0.05

3 讨论

UC在全球范围内困扰着上百万人，但是有效的治疗方法仍然缺乏，寻找治疗UC的新方法尤为迫切。UC治疗困难的主要原因是肠黏膜上皮持续反复的损伤或破坏以及黏膜修复功能障碍[9]，越来越多证据[10]表明，干细胞移植是修复受损肠黏膜的有效手段，事实上，许多研究[11]表明BMSCs在动物模型或临床试验中对各种炎性及自身免疫性疾病的治疗是有效的，这与该研究得到的结论一致，并且，已有BMSCs治疗临床病例(如顽固性自身免疫性关节炎等)的成功报道[12]，其安全性、有效性均得到部分证实。

该研究从小鼠骨髓中分离BMSCs并将其移植到DSS诱导的UC小鼠模型中，结果显示BMSCs移植能够改善UC小鼠的疾病状况，并能减轻UC小鼠模型肠黏膜损伤，促进受损黏膜再生，提示BMSCs移植是治疗UC的一种有效的方法。同时，该研究验证了BMSCs对受损肠黏膜的修复作用不仅通过动员相应的成熟细胞替代受损组织细胞，还通过进入受伤组织的微环境并刺激生长因子包括HGF、c-Met及表皮生长因子[13]等进一步促进损伤组织细胞增殖，从而促进损伤组织的修复[14]。既往报道[15]显示BMSCs移植明显增加了炎症性肠病模型大鼠小肠损伤黏膜和隐窝层的厚度。该研究PCNA染色也发现BMSCs移植加速了受损结肠组织细胞的增殖；UC小鼠经BMSCs治疗后，2种经典的增殖相关分子c-Met和EGFR在受损结肠组织中表达也明显上调；此外，BMSCs移植后生长因子特别是HGF的表达水平也被证实升高。综上，该研究清楚表明BMSCs移植能够修复UC小鼠模型肠黏膜损伤。并且，潜在机制的研究表明BMSCs移植可促进HGF、c-Met、EGFR等细胞生长相关分子的表达，进而导致损伤肠黏膜细胞增殖，修复受损组织。

HGF是一种多功能生长因子，能刺激上皮细胞的运动、侵袭、增殖和形态形成，在损伤组织中，HGFA生成增多，使激活的HGF表达增多，从而发挥促细胞分化、再生修复作用。但在该研究中，HGFA的表达仅在实验对照组中呈现先下降后上升的趋势，与HGF在实验对照组中的表达趋势类似，实验组中HGFA表达的改变趋势与HGF的改变趋势并无明显关联，且HGFA在3组之间的表达并没有明显的规律性差异，可能暗示BMSCs的干预会影响HGFA的表达，这还需要进一步的研究证实。