张婷婷,康 慧,付璐璐,由春香,王小非,郝玉金

作物生物学国家重点实验室；山东果蔬优质高效生产协同创新中心/山东农业大学园艺科学与工程学院,山东 泰安271018

干旱、盐、渗透等环境胁迫是制约植物生长的主要非生物胁迫[1]，胁迫条件下会诱导ABA 的积累[2-4]。ABA 是植物体内最关键的调节因子之一，它可以调控植物的生长发育，提高植物对生物和非生物胁迫的抗性[5-7]。在高等植物中，存在两种信号途径调控植物对外界胁迫的应答，即ABA 依赖和ABA 非依赖的方式[1]。除了ABA 信号途径调控植物的抗性外，ABA 的生物合成和降解途径也参与植物抗性的调控[8-10]。有研究表明，干旱、低温、高盐都可以通过启动与ABA 相关的途径提高植物对环境胁迫的抗性[11]，例如，在拟南芥中，ABF3 可以结合在ABA 转导关键基因ABI5 的启动子上，激活ABI5 的表达，提高植物体内ABA 的含量，进而提高对盐胁迫的抗性[12]；拟南芥NGATHA1转录因子在脱水胁迫下通过激活NCED3基因诱导ABA 生物合成，提高植物对干旱的抗性[13]。因此，ABA 合成途径对于植物对外界环境的抵抗作用是十分重要的。

镉作为一种重金属，不仅会造成环境污染，还威胁到人类的健康[14]。植物吸收镉主要是通过根系[15]，过量镉的摄入会抑制植物的生长发育，甚至导致植物死亡[16]。镉胁迫是一种典型的氧化胁迫，会破坏植物体内的抗氧化系统[17]，遭遇镉毒害的植物，叶面和叶边缘会有黄色枯死细胞、茎杆变黄，甚至枯死[18]。植物进化出了很多抗镉胁迫的机制，如抑制镉离子的吸收和转运、改变根际pH、与根部微生物产生效应等[16]，其中，植物最主要的抗镉胁迫的调控机制是抗氧化系统，主要包括抗坏血酸、还原型谷胱甘肽等非酶抗氧化保护物和超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化保护酶类[19]，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等[20]。当植物遭受镉胁迫等氧化胁迫时，其体内的抗氧化酶类的活性和编码基因的表达都显著提高，从而增强植物的抗性[20-25]。

CYP707A 家族成员编码8′-羟化酶，参与ABA 的氧化分解[5,26-29]，它们主要在种子中表达，参与种子休眠和萌发的调控[30-32]，此外，过表达CYP707A1也可以降低植物对非生物胁迫的抗性[31]。实验前期对MdCYP707A1的研究发现，MdCYP707A1可以参与调控种子休眠、萌发、非生物胁迫[33]，本研究将MdCYP707A1在拟南芥中异源表达，进一步对其在非生物胁迫中的功能进行分析，旨在进一步揭示木本植物中ABA 合成途径调控逆境响应的机理，为完善ABA 信号途径的调控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与生长条件

本研究中所用的拟南芥野生型为哥伦比亚生态型（Col-0），培养拟南芥所用的培养基为MS 培养基[1/2MS+10 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂（pH 5.7）]，抗性培养基的配制是在MS 培养基的基础上加入相应浓度的ABA、PEG、NaCl 和CdCl2，用光照培养箱进行培养，条件为长日照（16 h 光照/8 h黑暗），温度为19～22 ℃。

1.2 RNA 的提取和荧光定量PCR

RNA 的提取采用试剂盒法，所用试剂盒为RNA plant plus Reagent 试剂盒（天根），反转录试剂盒为PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time，TaKaRa），反转录后的cDNA为荧光定量的模板。荧光定量PCR 以18S RNA为内参基因，UltraSYBR Mixture（with ROX）为荧光定量的染料，PCR 所用的反应体系如下：2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL，上游引物（10 mmol·L-1）1.0 μL，下游引物（10 μmol·L-1）1.0 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL，共20 μL。每个模板3 次生物学重复。荧光定量PCR 反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，56 ℃退火15 s，65 ℃延伸10 s，40 次循环。最后采用2-ΔΔCT法进行定量数据分析。PCR 所用引物在表1 中列出。

表1 基因克隆和定量PCR 所用引物Table 1 Primers used for gene cloning and quantitative PCR

1.3 拟南芥的遗传转化

本研究中所用的拟南芥遗传转化的方法参照Clough&Bent（1998）[34]的方法。拟南芥的遗传转化采用花序侵染的方法。将构建好的MdCYP707A1-PRI101载体[33]转化农杆菌4404 菌株，筛选阳性克隆，所用抗性板为300 mg·L-1利福平和30 mg·L-1卡那霉素。将阳性克隆的农杆菌在LB 液体培养基中28 ℃培养过夜，用侵染液悬浮使其OD 值为0.6～0.8，剪掉果夹，将刚刚展开的花苞浸入侵染液中15 S 左右，暗处理16 h 以上，放到长日照下正常生长。每隔1 周侵染1 次，连续侵染3 次。

将获得T0代拟南芥种子28 ℃烘干，进行无菌消毒处理。消毒所用试剂为70%的无水乙醇，消毒5 min，无菌水清洗一次，2%次氯酸钠溶液，消毒8 min，用无菌水将种子表面的次氯酸钠清洗干净，清洗5～7 遍后，用牙签将其点铺在含有60 mg·L-1卡那霉素的1/2 MS 固体培养基上，低温暗处理2～3 d，放到光照培养箱中生长10～15 d，将子叶保持绿色的幼苗转移到基质中，提取RNA 进行定量鉴定，收取表达量较高的种子进行逐代筛选，用纯合的T3代种子进行抗性实验研究。

1.4 拟南芥表型分析和生理指标的检测

根长的统计采用Image J 图片分析软件，将图像导入Image J 软件中，自定义比例尺等要素，获得根的实际长度。

拟南芥鲜质重获取：在天平上称取新鲜拟南芥幼苗，重复3 次，取平均值作为最终实验结果。

拟南芥叶绿素的检测采用丙酮法[35]，将拟南芥叶片浸泡在80%的丙酮中过夜，直至叶绿素完全提取，检测663 nm 和645 nm 波长下的吸光值，并用以下公式计算叶绿素的含量：Ca十b＝20.3×A645-8.04×A663。

1.5 GUS 染色和显微镜拍照

GUS 染色液的成分为0.5 mM K3[Fe(CN)6],0.5 mM K4[Fe(CN)6]·H2O,100 mM NaH2PO4·2H2O,100 mM Na2HPO4·12H2O,10 mM EDTA·Na2·2H2O,1 mM X-gluc。将各个时期的拟南芥组织取材，浸入侵染液，37 ℃染色3～5 h，在解剖显微镜下成像。实验重复3 次，n≥10。

1.6 过表达拟南芥的表型分析

消毒处理的拟南芥种子（Col-0，OX-2，OX-4，OX-6，）在MS 培养基上培养4 d，将长势一致的幼苗分别移到MS，MS+5 μmol·L-1ABA 和MS+10 μmol·L-1ABA、MS+3%PEG6000、MS+100 mM·L-1NaCl、MS+100 μmol·L-1CdCl2、MS+150 μmol·L-1CdCl2培养基上，放在相同生长条件下培养14 d 左右，进行表型观察和拍照。

1.7 过表达拟南芥的表型分析

以上所有试验结果为至少3 次生物学重复。作图采用GraphPad Prism 7 软件，数据分析采用Data Processing System（DPS 7.55）软件，显著性差异分析采用Tukey 方法。

2 结果与分析

2.1 MdCYP707A1 调控ABA 代谢

为了验证MdCYP707A1的功能，我们克隆了苹果中的MdCYP707A1[33]，并将其在拟南芥中异源表达，qRT-PCR 结果表明，转基因拟南芥中MdCYP707A1的表达量显著上调（图1），证明MdCYP707A1确实转入了拟南芥。此外，我们检测了MdCYP707A1过表达拟南芥中与ABA 合成相关的基因AtABI5和AtNCED3的表达，发现它们的表达量显著下调（图1），说明MdCYP707A1的过表达抑制了ABA合成相关基因的表达，进而抑制了ABA 的合成，与在愈伤中过表达MdCYP707A1的结果一致[33]。

图1 苹果MdCYP707A1 与拟南芥AtABI5 和AtNCED3 的表达分析Fig.1 Expression analysis of MdCYP707A1 in apple and AtABI5 and AtNCED3 in Arabidopsis thaliana

2.2 MdCYP707A1 在不同组织中的表达模式

已经有数据表明，MdCYP707A 基因家族在苹果的各个组织中都有表达，且在种子中表达量较高[33]。为了进一步验证MdCYP707A1的组织表达模式，我们将proMdCYP707A1-GUS转入拟南芥中，分别检测了1 d 幼苗、3 d 幼苗、5 d 幼苗、7 d 幼苗、14 d 幼苗，5 周的叶子、花后的叶子，茎生叶和茎、根、茎、花和果荚的GUS 染色情况，发现刚萌发的幼苗（图2，A）染色较深，说明MdCYP707A1参与种子萌发时的调控；在第3 天的幼苗中，子叶和下胚轴染色较深（图2，B）；而在第5、7、14天的幼苗中，GUS 活性主要在下胚轴中检测到，而在根中表达较弱（图2，C,D,E）；而在成熟的组织中，果荚中的GUS 活性较高（图2，F-L）。以上结果说明，MdCYP707A1主要在ABA 种子萌发与成熟中发挥功能，间接说明MdCYP707A1可能参与种子休眠等生理过程的调控。

图2 GUS 染色检测MdCYP707A1 在拟南芥各个组织中的表达Fig.2 GUS staining for detection of MdCYP707A1 expression in Arabidopsis thaliana tissues

2.3 过表达MdCYP707A1 对ABA 不敏感

鉴于MdCYP707A1是参与ABA 分解代谢的关键基因，我们检测了过表达MdCYP707A1拟南芥对ABA 的抗性。分别将萌发后4 d 的幼苗转移到MS、MS+5 μmol·L-1ABA 和MS+10 μmol·L-1ABA的培养基上，在长日照（16 光照/8 黑暗）下培养14 d 观察表型，结果表明，在MS 培养基上，野生型（Col-0）和过表达MdCYP707A1（OX-2，OX-4，OX-6）的拟南芥长势无明显差异，而在含有ABA的培养基上，过表达拟南芥长势显著好于野生型（图3），说明过表达MdCYP707A1对ABA 不敏感。

图3 拟南芥野生型（Col-0）、MdCYP707A1 转基因株系（OX-2、OX-4、OX-6）幼苗在ABA 处理下14 d 时的生长状态Fig.3 The seedlings of the wild type(Col-0)and MdCYP707A1 transgenic lines(OX-2,OX-4,OX-6)of Arabidopsis thaliana were treated with ABA for 14 days

ABA 处理后，过表达拟南芥（OX-2，OX-4，OX-6）根长、鲜重和叶绿素的含量都显著高于野生型（Col-0）（图4），说明过表达拟南芥（OX-2，OX-4，OX-6）提高对ABA 的抗性，即对ABA 敏感性降低。

图4 拟南芥野生型（Col-0）、MdCYP707A1 转基因株系（OX-2、OX-4、OX-6）幼苗经ABA 处理后14 d 的根长、鲜重和叶绿素含量Fig.4 Wild type(Col-0),MdCYP707A1 overexpression(OX-2,OX-4,OX-6)were treated with ABA for 20 days and determination of root length,fresh weight and chlorophyll content

2.4 MdCYP707A1 参与到不同的非生物抗性

非生物胁迫可以诱导ABA 的积累从而增强植物的抗性[5-7]，并且基于MdCYP707A1的转基因苹果愈伤组织对NaCl、PEG 和甘露醇的抗性降低[33]，因此，我们在拟南芥中检测过表达MdCYP707A1是否具有相同的功能。将在正常MS 培养基上培养4 d 的幼苗转移到MS、MS+3%PEG6000、MS+100 mM·L-1NaCl 的培养基上，在长日照条件下培养14 d 后观察表型。过表达拟南芥（OX-2，OX-4，OX-6）在加入PEG 和NaCl 的培养基上的长势显著弱于野生型（Col-0）（图5），说明过表达MdCYP707A1降低了对非生物胁迫（PEG 和NaCl）的抗性。

图5 拟南芥野生型（Col-0）MdCYP707A1 转基因株系（OX-2、OX-4、OX-6）幼苗在PEG 和NaCl 处理下14 d 时的生长状态Fig.5 The seedlings of the wild type(Col-0)and MdCYP707A1 transgenic lines(OX-2,OX-4,OX-6)of Arabidopsis thaliana were treated with PEG and NaCl for 14 days

PEG 和NaCl 处理后，过表达拟南芥（OX-2，OX-4，OX-6）根长、鲜重和叶绿素的含量都显著低于野生型（Col-0）（图6），说明表达拟南芥（OX-2，OX-4，OX-6）降低对PEG 和NaCl 的抗性。

图6 拟南芥野生型（Col-0）、MdCYP707A1 转基因株系（OX-2、OX-4、OX-6）幼苗经PEG 和NaCl 处理后14 d 的根长、鲜重和叶绿素含量Fig.6 Wild type(Col-0),MdCYP707A1 overexpression(OX-2,OX-4,OX-6)were treated with PEG and NaCl for 20 days and determination of root length,fresh weight and chlorophyll content

2.5 过表达MdCYP707A1 提高对镉胁迫的抗性

有研究表明，ABA 信号可以参与植物对镉胁迫的抗性[50,51]，因此我们想检测MdCYP707A1的过表达是否会影响拟南芥对镉的抗性。我们将MS培养基上生长4 d 的幼苗转移到MS、MS+100 μmol·L-1CdCl2、MS+150 μmol·L-1CdCl2的培养基上，在长日照条件下培养14 d 后，我们发现过表达拟南芥（OX-2，OX-4，OX-6）在加入CdCl2的培养基上的长势显著好于野生型（Col-0）（图7），说明过表达MdCYP707A1提高了对镉胁迫的抗性。

图7 拟南芥野生型（Col-0）、MdCYP707A1 转基因株系（OX-2、OX-4、OX-6）幼苗在CdCl2处理下14 d 时的生长状态Fig.7 The seedlings of the wild type(Col-0)and MdCYP707A1 transgenic lines(OX-2,OX-4,OX-6)of Arabidopsis thaliana were treated with CdCl2for 14 days

CdCl2处理后，过表达拟南芥（OX-2，OX-4，OX-6）根长、鲜重和叶绿素的含量都显著高于野生型（Col-0）（图6），说明表达拟南芥（OX-2，OX-4，OX-6）提高对CdCl2的抗性。

图8 拟南芥野生型（Col-0）、MdCYP707A1 转基因株系（OX-2、OX-4、OX-6）幼苗经CdCl2处理后14 d 的根长、鲜重和叶绿素含量Fig.8 Wild type(Col-0),MdCYP707A1 overexpression(OX-2,OX-4,OX-6)were treated with CdCl2for 20 days and determination of root length,fresh weight and chlorophyll content

2.6 过表达MdCYP707A1提高拟南芥中谷胱甘肽还原酶(AtGR1)和超氧化物歧化酶(AtFeSOD)基因的表达

镉胁迫会引起植株氧化胁迫的伤害，进而使植物的抗氧化系统产生变化，尤其是抗氧化酶的变化[17]，因此，我们检测了镉处理后，野生型（Col-0）和过表达拟南芥（OX-2，OX-4，OX-6）中谷胱甘肽还原酶（AtGR1）和超氧化物歧化酶（AtFeSOD）的表达，发现镉处理后，过表达拟南芥（OX-2，OX-4，OX-6）中AtGR1和AtFeSOD的表达量显著上调，说明过表达MdCYP707A1提高了抗氧化酶相关基因的表达，进而提高了对镉胁迫的抗性（图9）。

图9 镉处理后谷胱甘肽还原酶（AtGR1）和超氧化物歧化酶（AtFeSOD）的表达分析Fig.9 Expression analysis of glutathione reductase(AtGR1)and superoxide dismutase(AtFeSOD)after CdCl2treatment

3 讨论

ABA 的生物合成和分解途径既是相互独立又是相互影响的[36]，转基因材料的过表达实验表明，NCED 是ABA 合成中的限速酶[36,37]，而8′-羟化酶是ABA 氧化失活过程中的关键酶[28,39]，植物体内ABA 稳态的调控是一个复杂的网络，ABA 的动态平衡涉及到许多酶和转运蛋白的共同调控，越来越多的证据表明，ABA 的产生或失活相关基因的调控在ABA 稳态中发挥重要作用[39]。在先前的研究中，过表达MdCYP707A1愈伤组织，降低了ABA 合成基因ABI5和NCED3的表达[33]，本研究中，在拟南芥中过表达MdCYP707A1也降低了ABI5和NCED3的表达（图1），说明ABA 合成和分解途径是相互影响的，这可能与植物体内ABA 稳态的调控有关。

ABA 虽然是植物生长的抑制因子[41]，但是过表达降解ABA 的CYP707A 家族成员会抑制植株生长，例如，过表达番茄SlCYP707A1和桃PpeCYP707A1表现出植株矮小、叶面积减小的表型[42,43]，但是过表达桃PpeCYP707A1促进种子萌发，减少ABA 处理条件下叶片的黄化，对ABA 不敏感[42]，此外，过表达苹果MdCYP707A1愈伤组织降低对NaCl、PEG 和甘露醇的抗性，提高拟南芥种子的萌发率[33]。本研究对MdCYP707A1过表达拟南芥的幼苗进行了抗性研究。MdCYP707A1的过表达拟南芥在加入5 μmol·L-1ABA 和10 μmol·L-1ABA 的培养基上的长势明显好于野生型（图3），根长、鲜重、叶绿素等生理指标也显著高于野生型（图4），说明过表达MdCYP707A1对ABA 不敏感，与先前的研究一致。而在PEG 和NaCl 的培养基上，过表达MdCYP707A1长势显著低于野生型（图5），生理指标的检测与表型一致（图6），说明过表达MdCYP707A1拟南芥降低了对非生物胁迫的抗性。

镉胁迫是一种重金属胁迫，高浓度的镉会对植物产生毒害作用[44-46]，镉胁迫条件下，会诱导ABA的生物合成，提高小麦[47]、大麦[48]幼苗对镉的耐受性，降低芸薹属植物[49]和水稻[50,51]幼苗茎中镉的含量。外源ABA 会诱导植物体内镉含量增加，提高植物对镉胁迫的抗性[52]；另有研究表明，水稻体内的植物螯合蛋白合成酶2(OsPCS2)通过降低镉在水稻中的积累而提高了镉的耐受性[53]，因此，植物体内镉含量的高低不是判断植物耐受性的标准。有趣的是，本研究中发现，过表达ABA 分解代谢中的关键酶MdCYP707A1降低了对干旱、NaCl 等渗透胁迫的抗性，反而提高了对镉等氧化胁迫的抗性，过表达（OX-2，OX-4，OX-6）植株体内谷胱甘肽还原酶(AtGR1)和超氧化物歧化酶(AtFeSOD)的表达量也是上调的，说明过表达MdCYP707A1确实可以提高对镉胁迫的抗性。我们推测，ABA 在介导植物抗性方面发挥不同的作用，或者有其他机制参与到植物抗性的调控过程中，其中的机理还有待进一步解析。

苹果产业是一种有前景的果树产业，生产中苹果产业的发展受干旱、盐渍、重金属等外界环境的制约。本研究从ABA 合成和降解的角度出发，解析了MdCYP707A1基因在干旱、盐胁迫、镉胁迫中的部分功能，为进一步完善ABA 信号和生物合成的机理研究奠定了一定的基础。