梅 龙,卢朝辉,姚 敏,郑建武,顾国强,崔巧红

(1.西安交通大学医学部基础医学院病原生物学与免疫学系，陕西 西安 710061；2.步长制药，陕西 西安 710075)

泌尿生殖道感染和浅部真菌病是临床最常见的感染性疾病，对广大人民的健康造成威胁。红核妇洁洗液是步长制药研制的一种纯中药制剂，有解毒祛湿、杀虫止痒之功效，用于湿毒下注之阴痒、带下及感染性阴道炎，以及非特异性阴道炎的治疗。以往的实验研究发现红核妇洁洗液对细菌和白假丝酵母菌有较强的杀菌作用[1]，但对引起浅部真菌感染的表皮癣菌、毛癣菌和角层癣菌的杀菌作用尚不了解，更缺乏红核妇洁洗液对细菌、真菌体内感染的抗菌效果实验资料和数据。

本实验研究选取引起泌尿生殖道感染和皮肤毛发浅表感染的主要细菌和真菌，测定红核妇洁洗液对实验菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)、最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)及浓度-时间杀菌率，采用5倍、10倍、20倍稀释的红核妇洁洗液进行阴道局部淋洗法对大耳白兔细菌性、真菌性阴道炎模型进行实验性治疗，旨在对红核妇洁洗液的抗菌谱和体内、体外杀菌效果做较全面的实验研究，探讨红核妇洁洗液替代化学消毒剂、体外抗菌药物的可行性，为红核妇洁洗液的临床应用及应用范围拓展提供可靠的科研依据。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验药物

红核妇洁洗液：山东步长神州制药有限公司，批号20170713；洁尔阴洗液：四川恩威制药有限公司，批号1702017。

1.1.2实验菌株及菌号

①标准菌株11株：阴道加特纳菌(ATCC14018)，由中国疾病预防中心微生物流行病研究所提供；大肠埃希菌(ATCC25922)、绿脓假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、表皮葡萄球菌(CMCC26069)、乙型溶血性链球菌(CMCC32210)、普通变形杆菌(CMCC49027)、淋病奈瑟菌(CMCC29106)、粪链球菌(ATCC14506)、藤黄微球菌(CMCC28006)和白假丝酵母菌(CMCC85021)，均由中国医学细菌保藏中心提供。②临床分离株12株：光滑念珠菌(BUM12391)、热带念珠菌(BUM12247)、近平滑念珠菌(BUM12134)、克柔念珠菌(BUM12405)、红色毛癣菌(BUM12204)、须癣毛癣菌(BUM07116)、断发毛癣菌(BUM07902)、疣状毛癣菌(BUM07926)、犬小孢子菌(BUM07943)、絮状表皮癣菌(BUM12202)、紫色毛癣菌(BUM07969)、糠秕状鳞斑癣菌(马拉色菌)(BUM07885)，均由北京大学真菌和真菌病研究中心提供。

1.1.3实验动物

日本大耳白兔，雌性，体重(2.00±0.25)kg，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，合格证号SCXK(陕)2012-003。

1.1.4主要试剂

苯甲酸雌二醇注射液(批号170522)；氢化可的松注射液(批号17080311)；甘露醇高盐琼脂、麦康凯琼脂、米勒—海顿肉汤(MHB)、米勒—海顿琼脂(MHA)、沙保弱肉汤(SDB)、沙保弱琼脂(SDA)购自上海中科昆虫生物技术开发有限公司。吉姆萨染液、HE染液、3.7%甲醛PBS中性组织固定液购自南京森贝伽生物科技有限公司。

1.1.5主要仪器和器械

DHP-9162型电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；MPS/P2石蜡包埋中心(德国SLEE公司)；CUT 6062全自动旋转式切片机(德国SLEE公司)；DXM 1200F数码显微成像系统(日本尼康公司)；1～200μL可调微量移液器(瑞士Mettler Toledo公司)。24孔细胞培养板、96孔细胞培养板、9cm培养皿均采用美国Costar公司产品。

1.2实验方法

1.2.1 MIC、MBC测定

用MHB(用于细菌)、SDB(用于念珠菌和毛癣菌)将红核妇洁洗液进行连续二倍梯度稀释，细菌和念珠菌加至96孔培养板0.2mL/孔，滴加106菌落形成单位(colony forming unit,CFU)/mL菌液10μL/孔，置于37℃培养48h；毛癣菌加至24孔板，1.5mL/孔。滴加2×105CFU/mL菌液50μL/孔，在28℃、80%相对湿度(relative humidity,RH)下培养7～10天。无细菌/真菌生长孔对应的最小药浓度为MIC。将无细菌/真菌生长孔中的液体充分混合，细菌、念珠菌吸取10μL接种到0.2mL MHB/SDB培养液，在37℃下培养48h；毛癣菌吸取0.1mL接种到1.5mL SDB培养基中，在28℃、80%RH下培养7～10天。无细菌/真菌生长孔对应的最小药浓度为MBC。

1.2.2浓度—时间杀菌曲线测定

1.2.2.1细菌杀菌曲线测定 将3×107CFU/mL细菌实验菌液0.5mL与药液5mL混合并计时。红核妇洁洗液原液于混合后0s(对照)、15s、30s、60s、90s和2min时间点采样；5倍和10倍稀释液于混合后0s(对照)、1min、2min、3min、4min和5min时间点采样。样本经10-2稀释后取1.0mL加入培养皿，与56℃保温的液态MHA 20mL充分混合静置待凝。37℃培养48h，进行菌落计数。

1.2.2.2真菌杀菌曲线测定 将2×105个/mL实验菌液0.1mL与药液5mL混合并计时。红核妇洁洗液原液在加入菌液0s(对照)、30s、1min、2min、3min和5min采样。5倍和10倍稀释液于加入菌液5、10、15、20、30min采样。样本液经10-2稀释取1.0mL加到培养皿，与56℃保温的液态5%氯霉素SDA 20mL混合静置待凝。念珠菌置于37℃下培养48h，毛癣菌置于28℃、80%RH下培养7～10天，进行菌落计数。

1.2.2.3杀菌率计算 每个时间点平行3个平板的菌落数平均值作为该时间点的活菌数。杀菌率=(对照组活菌数-实验组活菌数)/对照组活菌数×100%。

1.2.3阴道炎动物模型的建立

1.2.3.1感染菌液制备 金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌按1∶1比例配成1×109CFU/mL感染菌液用于细菌性阴道炎模型，白假丝酵母菌配成5×107CFU/mL菌液用于真菌性阴道炎模型。

1.2.3.2感染模型建立 于接种菌液前6天对兔子皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.15mg/kg，以后每两天注射一次直至造模成功。接种菌液前3天，每日肌肉注射氢化可的松1.5mg/kg直至造模成功。将感染菌液0.2mL注入兔子阴道内5～6cm处，1次/日，连续接种3天。末次接种后逐日检查、观察兔子阴道外观情况，取阴道分泌物检测阴道清洁度，革兰染色检查感染菌大致数量。

1.2.3.3造模结果 细菌性阴道炎模型组兔子于末次接种后第3天、真菌性阴道炎模型组兔子末次接种后第4天均发生典型炎症反应：阴道外观出现红肿、充血，阴道清洁度达到Ⅲ度或Ⅳ度，涂片中有大量感染菌，阴道炎模型制备成功。

1.2.4动物分组及给药

造模成功的动物随机分为模型组、阳性药对照组，以及红核妇洁洗液高、中、低剂量治疗组，同时设立未感染过病菌经检查阴道正常的兔子为正常对照组。细菌性阴道炎项目和真菌性阴道炎项目各6组，每组6只兔子。将无菌硅胶管插入兔子阴道5cm左右，以1～2滴/s的流速用药液连续淋洗5min，2次/日，连续治疗7天。红核妇洁洗液高、中、低剂量治疗组分别用5、10、20倍稀释的红核妇洁洗液，阳性药对照组用10倍稀释的洁尔阴洗液，阴道炎模型组、正常对照组用无菌纯净水。

1.2.5检测项目

1.2.5.1阴道白细胞数检查和阴道清洁度评定

首次给药治疗前和给药后第3、5、7日采集阴道灌洗液1mL，显微镜下计数灌洗液中白细胞数量，涂片染色镜下观察阴道杆菌、上皮细胞及杂菌，评定阴道清洁度。阴道清洁度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ度按1、2、3、4进行记分，计算各组兔子阴道清洁度积分值。

1.2.5.2感染菌活菌载菌量检测 于治疗前和治疗结束测定阴道灌洗液中感染菌的活菌载菌量。阴道灌洗液接种甘露醇高盐琼脂培养基测定金黄色葡萄球菌，接种麦康凯琼脂培养基测定大肠埃希菌，接种SDA培养基测定白假丝酵母菌。

1.2.5.3组织病理学检查 治疗7天后，取正常对照组、模型组、红核妇洁洗液中剂量治疗组兔子阴道前端和后端组织，固定、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色进行病理学检查。镜下观察炎性细胞浸润和阴道黏膜完整情况。按上皮炎细胞、上皮下炎细胞、上皮坏死、充血水肿的病变情况依照无(0分)、轻微(1分)、中等(2分)、严重(3分)进行评分，计算综合病理评分值。

1.2.5.4疗效判定 以治疗7天测定的阴道清洁度为判定指标，Ⅰ度判为痊愈，Ⅱ度判为好转，Ⅲ度以上为无效。

治愈率=痊愈的动物只数/各组的总动物数×100%。有效率=痊愈+好转的动物只数/各组的总动物数×100%。

1.3统计学方法

2结果

2.1 MIC和MBC结果

红核妇洁洗液对23株实验菌的MIC、MBC测定结果见表1。红核妇洁洗液对引起性传播性疾病的淋病奈瑟菌的MBC达到了0.016mL/mL，对引起细菌性阴道炎的阴道加特纳菌的MBC为0.031mL/mL，对引起真菌性阴道炎、皮肤黏膜念珠菌病的白假丝酵母菌的MBC为0.031mL/mL，对红色毛癣菌、马拉色菌的MBC为0.063mL/mL和0.031mL/mL。红核妇洁洗液对实验所选取的23株病原菌的MIC在0.008～0.063之间，MBC在0.016～0.063mL/mL之间。

表1 红核妇洁洗液对23株实验菌株的MIC和MBC (mL/mL)Table 1 The MIC and MBC of HHFJ lotion against 23 strains of experimental microorganism (mL/mL)

2.2浓度—时间杀菌率结果

红核妇洁洗液原液、5倍稀释液、10倍稀释液对23株实验菌的杀菌率见表2、表3、表4、表5、表6、表7。结果显示，红核妇洁洗液原液杀菌作用非常强大，对9株细菌作用15s杀菌率即可达100%；对绿脓假单胞菌作用30s杀菌率达100%；对念珠菌(单细胞真菌)作用1min杀菌率可达100%，对毛癣菌(多细胞真菌)作用2min杀菌率达100%。5倍稀释后，达到100%杀菌率所需时间明显延长，杀灭细菌需要3min，杀灭真菌需要30min。10倍稀释的红核妇洁洗液100%杀灭细菌需要4～5min，对白假丝酵母菌连续作用30min可达到100%杀菌率，而对其余真菌菌株连续作用30min杀菌率在42%～95%之间。

表2 红核妇洁洗液原液对细菌的杀菌率 (n)Table 2 Sterilization rate of concentrate of HHFJ lotion against bacteria (n)

注：活菌数单位为CUF/平板。

表3 红核妇洁洗液原液对真菌的杀菌率 (n)Table 3 Sterilization rate of concentrate of HHFJ lotion against fungi (n)

注：活菌数单位为CUF/平板。

表4 红核妇洁洗液5倍稀释液对细菌的杀菌率 (n)Table 4 Sterilization rate of 5 times diluent of HHFJ lotion against bacteria (n)

注：活菌数单位为CUF/平板。

表5 红核妇洁洗液5倍稀释液对真菌的杀菌率 (n)Table 5 Sterilization rate of 5 times diluent of HHFJ lotion against fungi (n)

注：活菌数单位为CUF/平板。

表6 红核妇洁洗液10倍稀释液对细菌的杀菌率 (n)Table 6 Sterilization rate of 10 times diluent of HHFJ lotion against bacteria (n)

注：活菌数单位为CUF/平板。

表7 红核妇洁洗液10倍稀释液对真菌的杀菌率 (n)Table 7 Sterilization rate of 10 times diluent of HHFJ lotion against fungi (n)

注：活菌数单位为CUF/平板。

2.3阴道外观检查结果

兔子阴道外观照片见图1。正常对照组兔子阴道外观表面湿润清洁，无充血，无脓性分泌物(见图1A)。真菌性炎阴道炎模型组兔子阴道红肿、充血，并有大量脓性分泌物(见图1B)。红核妇洁洗液治疗组兔子阴道肿胀充血减轻，分泌物减少(见图1C)。

注：A为正常对照组；B为真菌性阴道炎模型组；C为红核妇洁洗液中剂量治疗组。

图1真菌性阴道炎组大耳白兔阴道外观

Fig.1 Vaginal appearance of rabbits with colpomycosis

2.4阴道灌洗液中白细胞数及阴道清洁度变化

细菌性阴道炎兔子治疗第3天，红核妇洁洗液高、中剂量组白细胞数均低于模型组(均P<0.05)，治疗第5、第7天，红核妇洁洗液各剂量组及阳性药洁尔阴对照组白细胞数均低于模型组(均P<0.05)；治疗第5天，红核妇洁洗液高剂量组阴道清洁度低于模型组(P<0.05)，治疗第7天，红核妇洁洗液各剂量组及阳性药洁尔阴对照组阴道清洁度均低于模型组(均P<0.05)，见表8和表9。

表8 红核妇洁洗液对细菌性阴道炎兔子阴道灌洗液中白细胞数的影响 Table 8 The effects of HHFJ lotion on the count of leukocyte in vaginal lavage fluid of bacterial vaginitis rabbits

注：*与模型组比较，均P<0.05。

表9 红核妇洁洗液对细菌性阴道炎兔子阴道清洁度的影响Table 9 The effects of HHFJ lotion on vaginal cleanliness of bacterial vaginitis rabbits

注：*与模型组比较，均P<0.05。

真菌性阴道炎兔子治疗第3天，红核妇洁洗液高剂量组白细胞数低于模型组(P<0.05)，治疗第5、第7天，红核妇洁洗液各剂量组及阳性药洁尔阴对照组白细胞数均低于模型组(均P<0.05)；治疗第5、第7天，红核妇洁洗液高、中剂量组及阳性药洁尔阴对照组阴道清洁度均显著低于模型组(均P<0.05)，红核妇洁洗液各剂量组阴道清洁度在治疗全程与阳性药洁尔阴对照组比较无显著差异(均P>0.05)。见表10和表11。

表10 红核妇洁洗液对真菌性阴道炎兔子阴道灌洗液中白细胞数的影响Table 10 The effects of HHFJ lotion on the count of leukocyte in vaginal lavage fluid of rabbits with colpomycosis

注：*与模型组比较，P<0.05。

表11 红核妇洁洗液对真菌性阴道炎兔子阴道清洁度的影响Table 11 The effects of HHFJ lotion on vaginal cleanliness of rabbits with colpomycosis

注：*与模型组比较，P<0.05。

2.5阴道灌洗液中感染菌活菌数的变化

治疗前各组阴道灌洗液中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌的差异均无统计学意义(均P>0.05)。治疗后，红核妇洁洗液各剂量组兔子阴道灌洗液中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌载菌量均显著低于模型组(均P<0.05)。见表12。

2.6阴道组织病理学检查结果

阴道组织病理学切片镜下检查发现，正常对照组兔子阴道黏膜上皮被覆复层扁平上皮，排列整齐无脱落及增生；阴道皱壁指状突起，上皮下间质无水肿，富含血管，未见明显炎症细胞浸润(见图2A)。阴道炎模型组兔子阴道黏膜上皮厚薄不均，表面及上皮内可见大量炎细胞浸润，局部上皮有脱落；阴道皱壁粗大，上皮下间质明显水肿，内含大量灶状及散在炎细胞浸润，血管明显扩张充血(见图2B)。红核妇洁洗液中剂量治疗组兔子阴道黏膜上皮较规整，表面及上皮内也可见少量炎细胞浸润，小部分区域上皮有坏死脱落；阴道皱壁粗乳头状，上皮下间质轻度水肿，其内可见少量炎细胞浸润，血管轻度扩张充血(见图2C)。组织病理学评分结果见表13，疗效统计结果见表14。

细菌性阴道炎治疗组和真菌性阴道炎治疗组的病理学评分均显著低于模型组(均P<0.05)。红核妇洁洗液高、中、低剂量组对细菌性阴道炎和真菌性阴道炎的治愈率和有效率均明显高于模型组(均P<0.05)，表明红核妇洁洗液对细菌性阴道炎、真菌性阴道炎有良好的治疗效果，见表13、表14。

表12 红核妇洁洗液治疗前后各组大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌活菌数变化Table 12 The viable count of Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Candida albicans before and after treatment by HHFJ lotion in vagina of rabbits

注：*与模型组比较，P<0.05。

表13 病理学检查评分结果Table 13 Scores of pathological examination

注：*与模型组比较，P<0.05；分别取阴道前端和后端组织，n=2×6。

表14 红核妇洁洗液治疗感染性阴道炎的疗效 (%)Table 14 The efficacy of HHFJ lotion in the treatment of infectious vaginitis in rabbits (%)

注：*与模型组比较，P<0.05。

3讨论

3.1红核妇洁洗液体外抗泌尿生殖道感染菌、抗浅表感染真菌的活性及机理

由于阴道与尿道、肛门毗邻的生理解剖特性，内有阴道长居微生物群，外阴部又有各种不同的微生物共存，阴道易受到粪便中微生物、外阴部微生物和周围组织分泌物的污染，进而造成感染。细菌性阴道炎和真菌性阴道炎等妇科感染性疾病，已成为临床最常见的感染性疾病之一，患病率高达42.9%[2]。妇科感染具有易反复发作、易合并其他种类阴道炎症、难以治愈等特点，给妇女的身心健康带来严重的影响。引起细菌性阴道病的主要病原体为阴道加特纳菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌等，真菌性阴道炎最主要的病原体为白假丝酵母菌。淋病奈瑟菌、动弯杆菌、类杆菌、消化链球菌等厌氧菌，以及解脲支原体、疱疹病毒、人乳头瘤病毒等都是参与泌尿生殖道感染的重要病原体。

浅部真菌感染是由皮肤癣菌等致病菌感染皮肤角质层、毛发和甲板引起的感染，是各类感染性皮肤病中就诊人数最多的常见病和多发病。近年来，由于肥胖、外用糖皮质激素类药物滥用、糖尿病发病率升高及不良生活习惯等因素导致临床浅部真菌感染的就诊人数逐年增高，体癣和脂溢性皮炎增多尤为明显。临床治疗浅部真菌感染以抗感染、杀菌、去屑去脂和止痒为主，但耐药菌株的不断涌现使得一些传统抗真菌药物的抗菌效果大打折扣，激素的长期应用也给患者带来了不少副作用[3]。

红核妇洁洗液是由山楂核干馏液精制而成的外用洗液，其天然的酸性成分符合女性自然的阴道酸性微环境。现代化学及药理研究显示，山楂核富含300多种有效活性成分，主要为有机酸、有机胺、酮类、醛类、酚类等[4]，具有抗菌、抗氧化、抗炎及抗肿瘤等多种生物学活性[5]。其中的有机酸、有机胺类化学物质可以引起蛋白变性或沉淀，干扰细菌的糖代谢过程和氧化酶系统，抑制蛋白质分泌，抑制细胞壁降解酶，引起细胞破裂或溶解,对病原体有抑制和杀灭作用[6-7]。

体外抗菌实验选取的菌株涵盖了引起泌尿生殖道感染和浅表皮肤感染的主要细菌和真菌，结果显示红核妇洁洗液对23株实验菌株均有显著的杀灭和抑制作用。红核妇洁洗液原液浓度杀菌作用快速强大，能够在15s内杀灭细菌，30s内杀灭念珠菌(单细胞真菌)，2min内杀灭毛癣菌(多细胞真菌)。红核妇洁洗液抗菌活性随着稀释倍数增大而逐渐降低，10倍稀释时对细菌依然保持较强的杀菌作用，但对真菌的杀菌作用减弱。本实验结果表明红核妇洁洗液抗菌谱广，抑菌杀菌作用明显。红核妇洁洗液还具有止痒促愈合的作用[8]，其原液可用于皮肤感染局部的消毒，以及脚气、汗斑、癣症及脂溢性脱发等真菌浅表感染的治疗。

3.2红核妇洁洗液治疗兔感染性阴道炎的效果及机理

正常人和动物阴道有完整的微生物膜保护，长居菌群与机体之间处于平衡状态，不易被条件致病菌感染而患病。阴道炎多发生于机体菌群失调、免疫功能低下或免疫功能紊乱时[9]。本实验采用皮下注射雌激素造成兔子假发情状态，同时肌肉注射皮质激素降低兔子的免疫功能，随后阴道局部连续接种大剂量的感染菌液，促进感染性阴道炎模型建立。兔子于末次接种感染菌后第3天出现外阴红肿充血，有脓性分泌物，阴道清洁度达到Ⅲ级以上，成功建立了细菌性、真菌性阴道炎模型。

阴道感染局部的感染菌活菌载菌量能够反映出药物在临床应用中的体内抗菌效果，我们于给药前和给药7日治疗结束分别测定了阴道灌洗液中感染菌的活菌载菌量。结果显示，红核妇洁洗液各剂量组兔子阴道灌洗液中大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌的活菌数均显著低于模型组(P<0.05)，表明红核妇洁洗液能够有效的杀灭和抑制阴道的感染菌，为阻止感染的扩散和发展在源头上提供了保证。

白细胞是重要的炎症细胞，也是评价阴道清洁度的最重要指标，阴道炎症局部的白细胞数和阴道清洁度能够反映出炎症的严重程度。治疗期间兔子阴道灌洗液白细胞数和阴道清洁度的动态检测结果显示，红核妇洁洗液高、中剂量阴道白细胞数、阴道清洁度都显著低于模型组(均P<0.05)。

病理学检查可以反映出阴道炎症局部的组织病理学变化。对正常组、模型组和红核妇洁洗液中剂量(10倍稀释浓度)治疗组兔子阴道组织病理学检查的结果显示，治疗组兔子阴道组织中上皮和上皮下炎细胞、上皮坏死、充血水肿等指标及病理学综合评分均显著低于模型组(均P<0.05)。该实验结果表明红核妇洁洗液能够有效地消除炎症，促进组织修复。

红核妇洁洗液高剂量对细菌性阴道炎和真菌性阴道炎治愈率分别为83.33%和66.67%，中剂量组对细菌性阴道炎和真菌性阴道炎治愈率分别为66.67%和50.00%，有效率均达100.00%。低剂量组对细菌性阴道炎和真菌性阴道炎治愈率均为50.00%，有效率分别为100.00%和83.33%。结合体外抗菌的浓度杀菌曲线结果，红核妇洁洗液在不低于10倍稀释时使用对感染性阴道炎具有较满意的治疗效果。

红核妇洁洗液治疗阴道炎的机理，首先是杀菌抑菌作用消除了感染的根源。其次，山楂核萃取物中所含的木脂素类化合物能够抑制一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)等炎症因子的生成[10-11]，从分子水平对炎症进行调控，从而减轻和消除炎症。红核妇洁洗液还具有促进愈合的作用，能够促进损伤组织的修复。

红核妇洁洗液使用简单方便，无毒性无刺激性，疗效显著，是治疗感染性阴道炎的可靠辅助药物。对于临床常见的脚气、癣症及脂溢性脱发等真菌浅表感染具有良好的应用前景。