蔡其刚　唐一波　高小龙　仝丽娜　赵静　张红见

摘要  为了建立特异性、敏感性和适用性强的LAMP检测方法，采用分子生物学方法，根据GenBank数据库中该细菌的outL基因，进行了多序列比对和保守区域确定。根据其保守序列，在线设计和筛选了一套LAMP引物。温度优化及特异性和敏感性验证后建立了检测该病菌的LAMP检测方法，并对青藏高原放牧牛、羊临床粪便样品进行了检测。结果表明，LAMP检测方法的最适温度为63 ℃;检测其与大肠杆菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌及蜡样芽胞杆菌无交叉反应;检测下限为100 fg目的基因;利用建立的方法检测了208份放牧牦牛、藏羊粪便DNA样品，共检测到26份阳性样品，阳性率为12.5%。这表明成功建立了一种检测该病的特异性、敏感性和适用性强的LAMP检测方法。

关键词  放牧家畜;小肠结肠炎耶尔森氏菌;LAMP;outL基因;敏感性;特异性

中图分类号  S852.6    文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2019）24-0107-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.032

Establishment and Application of LAMP Detection Method for Yersinia enterocolitica in Grazing Livestock in Qinghai-Tibet Plateau

CAI Qi-gang1，TANG Yi-bo2，GAO Xiao-long2 et al  （1.Academy of Animal Science and Veterinary Medicine，Qinghai University，Xining，Qinghai  810016;2.College of Agriculture and Animal Husbandry，Qinghai University，Xining，Qinghai 810016）

Abstract  In order to establish a LAMP detection method with high sensitivity，specificity and applicability for Yersinia enterocolitica，outL gene sequences of Y.enterocolitica were downloaded from GenBank database to make multiple sequences blast by using molecular biology method.The conserved regions of the gene were determined.Based on the sequences of conserved gene，a set of LAMP primers were designed and screened out online.The LAMP method was established after temperature optimization，sensitivity and specificity verification.The clinical stool samples of grazing cattle and sheep were detected by the LAMP detection method.The results showed that the optimal temperature for LAMP detection method was 63 ℃.There was no cross-reactivity with Escherichia coli，Salmonella，Enterobacter sakazakii，Staphylococcus aureus，Pasteurella multocida and Bacillus cereus. The detection limit was 100 fg of the target gene.26 positive samples were detected among 208 fecal DNA samples of yak and Tibet sheep，the positive rate was 12.5%.These results demonstrated that a LAMP method for the detection of Y.enterocolitica with high sensitivity，specificity and applicability was established.

Key words  Grazing livestock;Yersinia enterocolitica;LAMP;outL gene;Sensitivity;Specificity

基金项目  国家自然科学基金项目（31560695，31560701）;青海省农牧厅项目（NMSY-2016-07，NMSY-2018-03）。

作者简介  蔡其刚（1981—），男，河南商丘人，副研究员，博士，从事动物疫病诊断防治研究。*通信作者，教授，硕士，硕士生导师，从事青藏高原畜禽传染病的诊断与防治研究。

收稿日期  2019-06-08

小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）簡称耶氏菌，是一种革兰氏阴性菌，能引起人和多种动物的耶氏菌病。在欧洲，该病是常见的第三大食源性细菌性疾病，排在前2位的分别是肠沙门氏菌和空肠弯曲杆菌[1]。大多数情况下，该病都是由耶氏菌感染所致，可导致患病动物产生各种临床症状，如发烧、腹痛和腹泻等[2]，在世界范围内造成了极大的经济损失。其流行病学尚不清楚，通常认为人感染该病主要是通过食用未煮熟的动物产品或饮用污染了耶氏菌的水而感染[3-5]。环介导等温扩增反应（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是近年来发展较快的一种检测方法，该方法最大的优点是通常在1 h内即可将目的基因扩增到1×109 倍，且操作简单、快速、敏感性高和特异性强，无需特殊仪器。因此，LAMP方法已被广泛应用于包括多种细菌、病毒以及寄生虫等病原的快速检测研究[6-9]。

为了检测放牧牦牛、藏羊群中耶氏菌病的感染情况，进而对环境中该病菌的污染情况和人感染风险进行评估，笔者针对该病菌的outL基因保守序列，综合利用分子生物学相关技术，建立了LAMP快速检测方法，并利用建立的LAMP检测方法，对来自青海省和西藏自治区的208份放牧牦牛、藏羊粪便样品进行了检测。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  标准菌株与对照菌株。

耶氏菌标准菌株（ATCC23715），购自北京中科质检生物技术有限公司;对照菌株大肠杆菌（E.coli）、沙门氏菌（Salmonella）、阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）及蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus），均由青海大学农学院动物医学系兽医传染病学实验室提供。

1.1.2  主要试剂及仪器。

1.1.2.1  试剂。改良磷酸缓盐冲液（PSB）培养基，购自杭州微生物试剂有限公司;细菌基因组快速抽提试剂盒，购自北京艾比根生物技术有限公司;粪便基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）、核酸替代染料、6×Loading Buffer、DL-2 000 Marker、2×Taq PCR Master Mix，购自天根生化科技（北京）有限公司;Loopamp DNA扩增试剂盒（环介导等温扩增法）及Loopamp荧光目视检测试剂盒，均购自荣研生物科技（中国）有限公司。

1.1.2.2  仪器。实时浊度仪（型号为LA-320C），购自日本荣研化学株式会社;核酸蛋白测定仪（型号为Bio photometer plus），购自德国Eppendorf公司;核酸电泳仪（型号为DYY-12）购自于北京六一生物科技有限公司;凝胶成像分析系统（型号为6300），购自上海天能科技有限公司。

1.1.3  引物。

根据NCBI网站中GenBank数据库登录的耶氏菌的outL基因（登录号为CP009846.1），使用生物学软件MEGA7.0比对outL基因的保守序列，按照LAMP方法的引物设计原则，在线（http：//primerexplorer.jp/elamp 4.0.0/index.html）设计并筛选针对outL基因的引物序列（表1）。HPLC级引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.4  标准菌株及对照菌株DNA。

纯培养的标准菌株（ATCC23715）和各对照菌株按照细菌基因组快速抽提试剂盒操作说明书提取细菌基因组DNA。

1.1.5  临床粪便样品DNA。

208份放牧牦牛、藏羊临床粪便样品分别采自青海省河南县、共和县、格尔木市、杂多县、久治县与及西藏那曲地区和日喀则市等地区。取1 g左右收集的粪便，置于5 mL灭菌PSB中，25 ℃下恒温摇床增菌培养24 h。然后，4 ℃、12 000 r/min下离心10 min，收集沉淀，用于粪便基因组总DNA提取，粪便DNA提取按照粪便基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）操作说明书进行操作。

1.2  方法

1.2.1  LAMP检测的建立及条件优化。

按照Loopamp DNA扩增试剂盒推荐的体系建立耶氏菌LAMP检测方法。反应体系（总体积为25 μL）如下：DNA模板2 μL，2 × 反应缓冲液（RM）12.5 μL，5 pmol/μL 的F3、B3引物各1 μL，40 pmol/μL的FIP、BIP引物各1 μL，20 pmol/μL 的LAMP荧光检测试剂（FD）1 μL，BstDNA聚合酶1 μL，去離子水4.5 μL。反应程序如下：60 ℃反应60 min，80 ℃灭活5 min。

试剂盒推荐反应时间为30～60 min。为了保证充分地扩增，首先扩增60 min进行LAMP扩增。为了摸索扩增反应的最适温度，以标准菌株（ATCC23715）DNA为模板，分别在60、61、62、63、64和65 ℃条件下，按照试剂盒推荐的体系使用实时浊度仪进行LAMP扩增，80 ℃灭活5 min后，将LAMP产物按1∶4稀释后，取2 μL加上样缓冲液进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.2  LAMP特异性。

利用建立的LAMP检测方法，在最适温度下，以提取的标准菌株（ATCC23715）及对照菌株的基因组DNA为模板，进行LAMP扩增，80 ℃灭活5 min。将LAMP产物按1∶4稀释后取2 μL加上样缓冲液进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。同时，以ATCC23715为模板，利用LAMP外引物F3、B3进行普通PCR扩增，扩增产物切胶回收后送交生工生物工程（上海））股份有限公司进行测序。测得序列在NCBI网站上进行在线比对，以验证引物的特异性。

1.2.3  LAMP敏感性。

将提取的标准菌株（ATCC23715）的DNA使用核酸蛋白浓度测定仪进行浓度测定，并进行连续10倍倍比稀释，即 1×10-1～1×10-8稀释，对原液和稀释后的DNA按照建立的LAMP方法，在最适温度下进行LMAP扩增，80 ℃灭活5 min。取2 μL LAMP产物加上样缓冲液进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4  LAMP临床样品的检测。

利用建立的LAMP方法对临床上采集并提取的208份粪便样品的DNA进行检测。

2  结果与分析

2.1  LAMP反应最适温度的确定

以提取的标准菌株（ATCC23715）DNA为模板，按照试剂盒推荐的25 μL反应体系配制LAMP反应液，并设置阴性对照反应。分别在60、61、62、63、64和65 ℃条件下进行LAMP扩增反应。将LAMP反应产物进行1∶4稀释后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。结果表明，阴性对照的LAMP反应产物没有可见的DNA条带，而加入DNA模板的6支PCR管中的LAMP反应产物均扩增出“阶梯状”的DNA条带，且反应温度为63 ℃的LAMP扩增产物条带最亮，DNA浓度最大，表明在63 ℃时LAMP反应扩增效率最高，63 ℃是最适反应温度（图1）。

2.2  LAMP反应特异性检测

利用建立的LAMP检测方法，在最适温度63 ℃下以提取的标准菌株（ATCC23715）和其他6种对照菌株的基因组DNA为模板进行LAMP扩增。电泳结果显示，只有标准菌株（ATCC23715）扩增出明显的“阶梯状”的DNA条带，而其他6株对照菌株和阴性对照均无可见DNA条带，表明建立的LAMP方法具有良好的特异性（图2）。同时，因为反应体系中加入了1 μL的FD，在紫外线下可见阳性样品呈现绿色荧光，而阴性对照没有荧光（图3）。用LAMP外引物对标准菌株ATCC23715的DNA进行普通PCR扩增，电泳结果显示获得约240 bp大小的DNA条带（图4），与预期大小一致。PCR产物测序后返回的序列与目的基因进行Blast比对，同源性达100%，因此LAMP和PCR扩增的条带均为目的基因。

2.4  LAMP反应临床样品的检测

利用建立的LAMP检测方法，对来自临床采集的208份放牧牦牛、藏羊粪便样品提取的DNA进行检测，结果共检测出阳性样品26份，阳性率为12.5%（26/208）。

3  討论与结论

耶氏菌是一种能引起人和动物严重的肠道疾病，主要症状有腹泻、胃肠炎、肠系膜淋巴结炎，严重的可引起败血症，在世界范围内造成了严重的经济损失[10]。目前，针对耶氏菌的检测，已经建立了很多方法，主要有免疫学检测和病原培养鉴定等[11-14]。此外，也有将病原培养、免疫和PCR检测相结合，检测食品中耶氏菌的报道[15]。然而，人们普遍认为PCR和Real-time PCR是鉴定耶氏菌的最有效、灵敏、且特异的检测方法[16-17]。

该研究通过对该细菌outL基因的保守序列，在线设计和筛选了一套LAMP引物，并建立了一种用于检测耶氏菌的敏感性、特异性和适用性强的LAMP检测方法。该方法通过LAMP技术检测样本中的DNA，与普通PCR技术相比LAMP方法对仪器和试验条件的要求更低，不需要专门的PCR仪。同时，LAMP方法的扩增效率更高，在1 h内即可做出定性判断。结果判断方法很多，除了可以进行琼脂糖凝胶电泳判定外，也可以根据浊度进行肉眼判断，或者在反应液中加入荧光试剂，在紫外光下判定。后2种方法均不需要对扩增后的反应液进行开盖，避免了DNA对试验环境的污染。与传统的细菌分离、培养鉴定方法相比，LAMP方法操作步骤简便，对操作人员的要求更低，也降低了对环境的污染和操作人员感染的风险。这极大地缩短了检测的总体时间，传统的细菌培养、鉴定至少需要5～6 d，而该方法在30 h内即可做出结果判定，且可以对大量的临床样本进行批量操作。

因此，在该病的检测、预防和控制过程中，建立的该LAMP方法为该病大量样本的流行病学调查及其风险分析提供了一个行之有效的检测工具，应在临床上大量推广使用。

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