李珍1，陈义三1，陈荣珠1，杨彩媚1，陈楠滨2，卢闻东

(1.福建省漳州卫生职业学院，福建 漳州 363000；2.福建省漳浦县旧镇镇人民政府，福建 漳州 363213；3.福建省热带作物科学研究所，福建 漳州 363001)

目前，有关连作障碍形成原因的研究已取得很大进展，归纳起来主要有植物化感自毒作用[1]、土壤理化性质恶化[2-3]、土壤微生物区系变化[4-5]等原因，这三大因素均与土壤存在密切关系。探讨连作障碍的成因和寻求消减连作障碍的措施，从植物—土壤—微生物组成的根际微生态系统出发，已成为当前的研究热点。植物体内的次生代谢物通过淋溶、凋落、根系分泌对微生物群落具有选择性塑造，使根际微生态系统失衡，对植物产生负反馈[6]。微生物是土壤物质循环、能量流动、养分周转的主要驱动力，有研究表明土壤微生物参与了90%左右的土壤反应过程[7-8]。因此，分析土壤微生物群落结构、功能的多样性和动态性信息，对了解植物连作障碍的形成原因具有重要意义。

生物炭因具有疏松多孔、取材方便、价格低廉、生态环保等特点，在缓解连作障碍方面具有很大的优势。研究表明[9-10]，连作土壤中添加一定量的生物炭，微生物的群落结构和功能得到调节，进而改善土壤的理化特性，有利于农作物的生长，对连作土壤产生的连作障碍有较明显的缓解作用。

然而，有关连作穿心莲根际土壤微生物的研究还未见报道。因此，本文采用田间对比试验，运用平板计数法、BIOLOG ECO微平板法和末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术，研究了有无添加生物炭对连作穿心莲根际土壤微生物的数量、结构和功能多样性的影响，探讨生物炭能否有效缓解穿心莲的连作自毒障碍，为穿心莲缓解连作障碍提供理论依据，为中药材绿色种植提供参考。

1 材料与方法

1.1 田间试验及取样方法

试验地设在漳州卫生职业学院药用植物园内，共设6个处理：种植1 a(正茬不加炭，记作1 a)、种植1 a[正茬加炭(250 kg/mu，下同)，记作1 a+C]、种植2 a(连作1 a，不加炭，记作2 a)、种植2 a(连作1 a，加炭，记作2 a+C)、种植3 a(连作2 a，不加炭，记作3 a)、种植3 a(连作2 a，加炭，记作3 a+C)。试验地块相邻，且均匀、平坦、整齐，具有当地代表性，每处理3次重复。穿心莲每年4月清明节前后播种，苗高10 cm左右移栽，行株距15×18 cm，水肥、中耕除草、病虫害防治等田间管理措施每年都一致，刚要现蕾时采收。

随机挖起3株穿心莲，采用抖根加毛刷的方法收集根际土壤，去除动植物残体等杂质，过2 mm筛。用四分法将土壤混匀，一部分置于4 ℃冰箱，用于土壤微生物的培养和多样性测定；另一部分-80 ℃保存，用于细菌测序。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 土壤微生物数量的测定 微生物数量用平板计数法统计每克干土内所含微生物的个数[11]。 细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基培养，放线菌采用高氏1号培养基培养，真菌采用马丁氏培养基培养。

1.2.2 土壤微生物结构和功能的测定 采用BIOLOG ECO微平板法[12]，称取10 g鲜土加入100 ml灭菌的生理盐水(质量分数：0.85%)中，120 r/ min-1振荡30 min，静置，取悬浊液，稀释至原浓度的1/1000，吸取150 ml样品接种于ECO的96孔板中。28 ℃培养，590 nm连续读数7 d。

1.2.3 土壤微生物细菌的测定 土壤微生物总DNA用土壤DNA提取试剂盒(OMEGA公司)提取，1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测。通用引物8F-FAM:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、926R:5'-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3' 扩增土壤细菌16SrDNA片段。扩增产物经电泳检测、切胶纯化，纯化后的PCR产物用HaeⅢ和Msp酶切，酶切产物送测序。登录http://mica.ibest.uidaho.edu/，选择T-RFLP Analysis(APLAUS+)，输入相关参数进行分析。

1.2.4 数据处理 平均颜色变化率(AWCD)用于表示土壤微生物代谢活性。

AWCD=∑ (Ci-Ri) /31 式中，Ci为每个有培养基孔的吸光值，Ri为对照孔的吸光值。

Shannon、Simpson和McIntosh三个指数用来衡量土壤微生物群落功能多样性。

Shannon指数(H) H = —∑Pi(InPi)

(1)

Simpson指数(D) D = 1—∑Pi 2

(2)

(3)

式中，Pi为第i孔的相对吸光值与所有孔相对吸光值总和的比值(Ci-Ri) / ∑ (Ci-Ri)，ni为第i孔的相对吸光值(Ci-Ri)。

用Excel 2007进行平均吸光值(AWCD)、多样性指数、显著性差异分析等工作，用Graphpad prism 7.0作图。

2 结果与分析

2.1 生物炭对连作穿心莲根际土壤微生物数量的影响

在穿心莲生长发育过程中，有无添加生物炭对连作穿心莲根际土壤微生物数量的影响见图1-图3。从图1可见，未添加生物炭时的细菌数量在0、30、60、90、120 d时，正茬分别是连作1 a的1.12、1.16、1.09、1.15、1.32倍，连作1 a分别是连作2 a的1.10、1.08、1.07、1.03、1.06倍，说明连作对穿心莲根际土壤的细菌数量有影响。添加生物炭后的细菌数量，在30、60、90、120 d时，连作1 a加炭分别是连作1 a不加炭的1.12、1.07、1.09、1.16倍，连作2 a加炭分别是连作2 a不加炭的1.19、1.09、1.09、1.18倍，说明添加生物炭能有效提升穿心莲根际土壤细菌数量。从图2可见，放线菌数量同细菌数量变化类似，同样为随着种植天数的增加先升高后下降。大小顺序为：正茬>连作1 a加炭>连作2 a加炭>连作1 a不加炭>连作2 a不加炭。在未添加生物炭时的放线菌数量，正茬与连作1 a差异显著；连作1 a与连作2 a除了第90 d外，其它时间点都达到了差异显著。添加生物炭后，连作1 a加炭与连作1 a不加炭在第60、90 d时无差异，在第30、120 d时，差异显著；连作2 a加炭与连作2 a不加炭均差异显著。从图3可见，真菌的数量随着种植天数的增加呈现不断上升的变化趋势。未添加生物炭时的真菌数量，在0、30、60、90、120 d时，连作1 a分别是正茬的1.05、1.11、1.09、1.11、1.23倍，连作2 a分别是连作1 a的1.09、1.03、1.00、1.04、1.01倍。但是，添加生物炭后的真菌数量，在30、60、90、120 d时，连作1 a加炭分别减少到连作1 a不加炭的88%、90%、93%、89%，连作2 a加炭分别减少到连作2 a不加炭的90%、89%、88%、91%。说明随着穿心莲连作年限的增加，土壤中的真菌数量不断变多；添加生物炭后，土壤中的真菌数量有所减少。

图1 生物炭对连作穿心莲土壤细菌数量的影响

图2 生物炭对连作穿心莲土壤放线菌数量的影响

图3 生物炭对连作穿心莲土壤真菌数量的影响

2.2 生物炭对连作穿心莲根际土壤微生物多样性的影响

平均颜色变化率(AWCD)是反映土壤微生物群落活性的重要指标。从表1可知，72 h的AWCD值，正茬的收获期最高；随着种植年限的延长，到第3年收获期，AWCD值呈下降趋势，且差异显著。说明此模式下根际土壤微生物的碳源代谢能力比正茬要差。多样性指标中，Shannon指数反映物种的丰富度，McIntosh指数反映物种的均匀度，Simpson指数反映物种的优势度。三者数值越大，表示土壤中微生物群落的功能多样性越高。表中，Shannon指数、McIntosh指数随着连作年限的延长呈下降趋势，且达到显著性差异；添加生物炭后，显著性差异消失。Simpson指数则不同，自始至终都无显著性差异。表明群落多样性虽有下降，但是却没有出现明显的优势种群。

表1 两种措施下穿心莲根际土壤微生物多样性指数和72 h AWCD

同一列中不同字母表示差异达到显著水平P<0.05，下同。

2.3 土壤微生物对不同类型碳源利用的差异

土壤微生物对不同碳源的利用状况可以反映微生物群落的代谢功能。从表2可见，随着种植年限的增加，6类碳源中，土壤微生物群落对碳水化合物、氨基酸、多聚物、胺类的利用能力逐渐下降，对羧酸、酚酸类的利用能力逐渐上升。在未添加生物炭时，碳水化合物、氨基酸、多聚物、胺类四大类，连作2 a比正茬分别下降了17.6%、25.6%、10.2%、26.5%；羧酸、酚酸类两大类分别上升了29.5%、43.1%。添加生物炭后，碳水化合物、氨基酸、多聚物、胺类四大类，连作2 a加炭比连作2 a不加炭，分别上升了10.7%、19.7%、5.1%、19.7%；羧酸、酚酸类两大类分别下降了13.9%、13.7%。说明随着连作年限的不同，土壤微生物对碳源的利用能力不同，连作提高了以羧酸、酚酸类化合物为代谢基质的微生物类群的活性，抑制了以碳水化合物、氨基酸、多聚物、胺类化合物为碳源基质的微生物群落的生长代谢。但是添加生物炭后，原先碳源利用能力下降的得到了不同程度的上升回调，原先碳源利用能力上升的得到了不同程度的下降回调。

表2 两种措施下穿心莲根际土壤微生物碳源利用的差异

2.4 生物炭对连作穿心莲根际土壤细菌菌群的影响

由表3可知，该10个门的菌占总菌量的88.45% 以上。其中变形菌门、酸杆菌门、放线菌门所占比例均大于10%，其余门类所占比例均低于10%。变形菌门、放线菌门在有无添加生物炭时，变化不大。酸杆菌门变化较大，未添加生物炭时，连作1 a、连作2 a分别比正茬上升了16.94%、46.30%；添加生物炭后，连作1 a加炭比不加炭下降了15.31%，连作2 a加炭比不加炭下降了22.30%。值得注意的是，种植第3 a时，出现了硝化螺旋菌门。

表3 两种措施下穿心莲根际土壤细菌前10大门水平的群落结构

3 讨论

随着穿心莲连作年限的增加，在未添加生物炭的情况下，土壤中可培养微生物总量、细菌、放线菌数量减少，真菌数量增多。这点从AWCD值得变化趋势可得到证实，无论是苗期，还是收获期，都呈下降趋势，且差异显著。多样性指数也可以从不同方面反映微生物群落结构和功能多样性变化。Shannon、McIntosh指数结果与可培养微生物数量、AWCD值一致，均随着连作年限增加显著下降，表明微生物数量和功能随连作年限增加而下降；但是Simpson指数在各连作年限间无差异，表明该过程中，微生物优势种群并未发生变化。根据微生物对不同类型碳源利用的差异可知，随着连作年限的增加，以碳水化合物、氨基酸、多聚物、胺类化合物为基质的微生物受到抑制，以羧酸、酚酸类化合物为基质的微生物得到提高。通过末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术检测，发现酸杆菌门变化较大。

综上所述，随着种植年限增加，穿心莲根际土壤微生物功能多样性降低，群落结构发生变化，这些因素共同作用是导致穿心莲连作障碍形成的主要原因。添加生物炭后，在相同种植年限的水平上比较，细菌、放线菌数量增加，真菌数量减少，Shannon、McIntosh指数增加，以羧酸、酚酸类化合物为基质的微生物得到抑制，酸杆菌门的细菌数量减少。穿心莲连作障碍得到缓解，连作2 a加炭的整体情况优于连作1 a不加炭。

本研究初步探讨了连作0-2 a穿心莲的大田试验，年限较短，后期还需延长年限进一步深入研究。