王晶晶，郝海生，杜卫华，刘 岩，庞云渭，赵善江，闫长亮，赵学明*，朱化彬

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，家畜胚胎工程与繁殖创新团队，北京 100193；2.中国牧工商（集团）总公司，北京 100070）

1977 年Whittingham[1]第1 次通过慢速冷冻法冷冻小鼠卵母细胞并解冻后成功产下子代，引起世界关注。Rall 首次发明了玻璃化冷冻法，该方法是通过在冷冻过程中使胞质溶液的黏度随温度降低而增加，形成无规则的玻璃化固体，通过减少冰晶形成而降低细胞损伤[2]。相较于慢速冷冻法，玻璃化冷冻法操作简便、成本低、伤害更低、效果更优[3]。卵母细胞玻璃化冷冻保存形成的卵子库消除了时间空间的差异[4]，保存生育力尤其是可能失去生育能力的妇女，并且避免了冷冻胚胎产生的宗教、道德、法律问题[5]，对家畜胚胎生物技术和人类辅助生殖都具有十分重要的意义。在小鼠卵母细胞玻璃化冷冻取得成功后，随后在猴子[6]、人[7]、兔[8]、牛[9]、马[10]等各种哺乳动物的玻璃化冷冻卵母细胞也取得成功。

虽然玻璃化冷冻卵母细胞有很多优良特性和便利条件，但仍与新鲜卵母细胞的发育潜力有很大差距。玻璃化冷冻的卵母细胞发育潜力降低，仍存在受精率、卵裂率、囊胚率较低等问题[11]。本文通过阐述玻璃化冷冻对卵母细胞造成的伤害，进一步了解玻璃化冷冻卵母细胞的变化，从而为改善玻璃化冷冻卵母细胞的质量提供思路。

1 玻璃化冷冻对卵母细胞细胞结构的影响

1.1 细胞核

1.1.1 GV 期卵母细胞和MII 期卵母细胞 玻璃化冷冻会导致小鼠GV 期卵母细胞核无秩序、不成熟的染色体压缩、核质的混合及卵母细胞核恢复之后细胞核碎片进入细胞质的具象化[12]，这可能不利于卵受精后的发育[12]（表1）。玻璃化冷冻小鼠GV 期卵母细胞体外成熟（IVM）后，姐妹染色体着丝点间的距离和非整倍体率高于对照组[13]；且玻璃化冷冻猪卵母细胞会有GV 期过早结束以及减数分裂异常现象的产生[14]。除此之外，玻璃化冷冻会使人卵母细胞染色体结构损坏显著升高[15]和牛卵母细胞DNA 碎片水平增加[16]。玻璃化冷冻不同时期的卵母细胞会对细胞核产生不同的影响。玻璃化冷冻GV 期卵母细胞会导致细胞核混乱及染色体异倍性增加，这可能与黏着素复合物的形成降低从而破坏了着丝粒的黏着性有关[13]。而玻璃化冷冻MII 期卵母细胞异倍性的状况优于GV 期，MII 期卵母细胞可能是避免非整倍体冷冻保存的理想选择[13]。玻璃化冷冻会造成水牛卵母细胞染色体排列异常[4]、小鼠卵母细胞染色体从赤道区域的偏离等[17]。可见，玻璃化冷冻的MII 期卵母细胞易产生染色体位置异常。

1.1.2 卵丘卵母细胞复合体（COCs） 牛[18]、羊[19]COCs 玻璃化冷冻后体外成熟（IVM）培养 24 h，卵母细胞细胞核成熟率显著降低，细胞骨架的解散可能是导致这一现象的原因[18]。玻璃化冷冻COCs 卵母细胞会不利于细胞核的成熟。卵丘细胞有利于细胞核的成熟，而暴露于抗冻保护剂会使卵丘细胞通过其与卵母细胞建立物理接触的跨区域投射内的肌动蛋白丝失去秩序[20]，这可能是核成熟率降低的原因。

1.2 细胞器 玻璃化冷冻对细胞核细胞质造成损伤的同时也会对卵母细胞细胞器造成较大伤害，包括细胞器的分布、结构和功能，这些伤害导致玻璃化冷冻的卵母细胞发育能力降低。

1.2.1 线粒体 玻璃化冷冻会破坏狐狸[21]和猪[22]卵母细胞线粒体正常分布及线粒体超微结构完整性[22]。在人上，玻璃化冷冻还会减少线粒体平滑内质网聚集[23]（表1）。研究表明，玻璃化冷冻会导致猪[22]、人[24]和牛[16]卵母细胞线粒体膜电位ΔΨm 显著降低，而ΔΨ 显著降低会诱发线粒体磷酸转运体和线粒体膜破裂导致凋亡蛋白等释放到膜间隙[16]。

1.2.2 纺锤体 纺锤体是检测冷冻损伤的灵敏指标之一，它对温度降低特别敏感，且研究证实有纺锤体的卵母细胞胚胎发育潜能较高[25]。研究表明，玻璃化冷冻人GV期卵母细胞在体外成熟至MII 期后会产生纺锤体结构损坏的现象[15]，同时玻璃化冷冻也会引起小鼠卵母细胞纺锤体紊乱和消失[26]以及猪卵母细胞纺锤体严重损伤[27]，这些异常都会导致体外受精后未分裂或染色体分裂异常，从而造成非整倍体形成（表1）。

1.2.3 微管、微丝、微绒毛 玻璃化冷冻会导致卵母细胞微丝网络的混乱[4]，而微丝和微管组织的变化会损害卵母细胞的发育能力[19]。Palmerini 等[23]研究表明，玻璃化冷冻会造成人GV 期卵母细胞40% 微绒毛超微结构异常、MII 期卵母细胞30%微绒毛超微结构异常。

1.2.4 皮质颗粒（CG） CG 分布和迁移的变化已成为卵母细胞成熟过程中评价胞质成熟的重要指标之一[28]。CG 分布混乱和功能异常对卵母细胞发育及受精产生不利影响，从而影响胚胎质量[28]。Palmerini 等[23]研究玻璃化冷冻人卵母细胞发现CG 在分布和基质电子密度上呈现异常；Wu 等[29]研究证明，玻璃化冷冻牛卵母细胞会出现CG 缺失（表1）。

1.3 细胞质 研究表明，玻璃化冷冻会对细胞质产生较大的伤害，包括核质混乱、细胞质成分GV 期前的破裂以及细胞质的无秩序[12]。脂质是细胞中最丰富、最重要的成分之一，其中胞质脂滴在细胞能量中起重要作用[30]。

冷冻保存会对卵母细胞造成渗透和冷冻损伤，导致其脂代谢和氧环境异常，从而影响其发育能力[19]。同时，在冷冻保存过程中，脂质相分离后相变是导致富含脂质卵母细胞冷冻损伤的主要原因之一[30]。另外，冷冻导致牛卵母细胞质内油脂含量增高[31]、脂滴形成[32]、脂质结构变化[32]等，同样会造成小鼠卵母细胞磷脂分布和表达量显著变化[33]（表1）。

表1 玻璃化冷冻对卵母细胞造成的伤害

2 玻璃化冷冻对卵母细胞重要蛋白和分子的影响

2.1 细胞重要蛋白

2.1.1 凋亡蛋白 细胞凋亡是降低哺乳动物卵母细胞发育潜能的主要因素之一[34]，而半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）家族在该过程中起关键作用。研究表明，Caspase 8[35]、Caspase 9[36]分别在死亡受体-介导的外源性凋亡通路和线粒体-介导的内源性凋亡通路中起到关键作用。有研究表明，玻璃化冷冻导致牛卵母细胞ΔΨm 降低，进而促进磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，并且激活caspase-3 蛋白表达，而caspase-3 蛋白的超表达会使DNA 碎片显著增加[16]。冷冻还会导致牛卵母细胞中caspase 8 和caspase 9 的表达增加[37]。

2.1.2 黏连蛋白 姐妹间着丝点距离与着丝粒内聚力有关，而丝粒内聚力与黏着素复合物的形成有关。有实验证明，玻璃化冷冻小鼠卵母细胞导致3 个黏连蛋白（SMC1β、STAG3、SMC3）的相对表达显著减少[13]，可以表明玻璃化冷冻通过影响黏着素复合物的形成而破坏着丝粒的黏着性，进一步影响卵母细胞的非整倍性，使得其非整倍性增高。自噬被广泛认为是由各种环境和细胞压力引起的生存或反应机制。玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的自嗜蛋白BECLIN1 表达增加[38]，这势必会影响卵母细胞进一步发育潜力。

2.2 细胞重要分子

2.2.1 腺嘌呤核苷三磷酸（ATP） 玻璃化解冻牛[39]、人[40]卵母细胞ATP 含量和ATP 合酶活性显著降低，这可能是由于其FAD/ NAD（P）H（黄素腺嘌呤二核苷酸/烟酰胺型辅酶）比率显著升高造成的[40]。

对ATP 来说，线粒体Ca2+是控制ATP 生产速度的一个重要组件，它控制线粒体通透性转换的发生，而这在细胞凋亡线粒体控制过程中发挥作用。大量Ca2+从内质网涌入细胞质，进而促进Ca2+涌入到线粒体[16]。Ca2+的涌入可以刺激线粒体新陈代谢和随后ROS 的生成增加，启动一系列事件导致氧化应激，从而增加Ca2+从内质网（ER）释放的可能性，这可能与玻璃化冷冻卵母细胞中ATP 的变化有关[16]。

2.2.2 ROS 玻璃化冷冻卵母细胞ROS 水平会显著升高，主要有2 个原因：①卵母细胞的脂质会产生大量ROS，从而影响氧化还原反应和细胞内抗氧化系统之间的平衡[41]；②线粒体损伤也会造成生产和清除ROS 间的失衡，导致净ROS 产生进而会加剧线粒体功能障碍，使ROS 的产量更高[17]。

高水平ROS 不仅会引起DNA 损伤、脂质过氧化反应和蛋白质氧化反应[42]，还能引起卵母细胞发育潜能降低[39]，从而对胚胎发育产生不利影响[43]。

2.2.3 Ca2+玻璃化冷冻会引起胞内Ca2+浓度升高，提前激活卵母细胞，使CG 提前释放，从而导致透明带硬化，影响受精效果[42]。有研究进一步表明，玻璃化冷冻会促使牛卵母细胞内质网Ca2+释放到细胞质中，提高胞内Ca2+和线粒体Ca2+水平，进而促进CG 提前释放以及线粒体功能异常[17]。因为线粒体依赖于Ca2+信号来实现自身功能，尤其是其产生ATP 的能力，Ca2+超载可能解释玻璃化卵母细胞中ΔΨm 的下降，而线粒体中ΔΨm 降低导致卵母细胞减数分裂装置异常，导致胚胎出现镶嵌混乱[16]。

2.2.4 谷胱甘肽（GSH） GSH 是一种重要的细胞内硫醇化合物，在细胞增殖、氨基酸转运、蛋白质和DNA合成以及氧化还原状态维持、清除细胞氧自由基[44]等诸多生物学功能中发挥重要作用[45]。在卵母细胞成熟过程中，GSH 的合成是精子染色质去致密化和雄性原核形成的前提[46]。研究表明，小鼠[47]、山羊[48]、牛[49]、猪[50]、犬[51]卵母细胞、银狐COCs 经玻璃化冷冻解冻、IVM 72 h 后，细胞中GSH 含量显著降低，而冷冻保护剂处理组与新鲜组之间GSH 含量无显著差异[21]。而成熟卵母细胞GSH 含量降低与胚胎发育能力差有关[45]。

3 展 望

相较于慢速冷冻法，玻璃化冷冻保存有诸多优势。玻璃化冷冻的卵母细胞解冻体外培养体外受精后卵裂率、囊胚率更高，胚胎移植后妊娠率更高和流产率较低。但玻璃化冷冻保存仍然会对卵母细胞造成不可忽视的损伤，包括细胞核、细胞质、细胞器等方面的变化，从而降低卵母细胞的发育潜力，最终影响胚胎质量。因此，如何缓解卵母细胞在玻璃化冷冻过程中受到的损伤，是促进该技术进一步发展的关键，也是未来该领域研究的趋势，如完善抗冻保护剂、进一步提升玻璃化冷冻解冻程序以及解冻后卵的恢复。