王宝珍，葛 辉

(1.福建省晋江市海洋与渔业技术服务中心，福建 晋江 362200；2.福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013)

珍珠龙胆石斑鱼，俗称龙虎斑或珍珠斑，是由鞍带石斑鱼(Epinepheluslanceolatus，俗称龙胆斑，父本)和棕点石斑鱼(E.fuscoguttatus，俗称老虎斑，母本)杂交培育的新品种。养殖实践表明，珍珠龙胆石斑鱼具有杂交优势，不仅将鞍带石斑鱼生长速度快和棕点石斑鱼抗病力强等特点集于一身，而且肉质细腻，营养价值高，已逐渐成为石斑鱼养殖的宠儿[1]。但近年来，随着高密度养殖技术推广、水环境污染、疾病防控不足等诸多因素影响，珍珠龙胆石斑鱼病害频繁发生。

2018年1月30日，厦门小嶝水产有限公司工厂化养殖的珍珠龙胆石斑鱼幼鱼(10 cm左右)出现“溃疡病”，10 d内累计死亡率超过20，造成巨大经济损失。本文以患溃疡病珍珠龙胆石斑鱼幼鱼为研究对象，分离致病菌株，采用形态学观察、16S rDNA鉴定、生理生化特征等方法进行菌株综合鉴定。研究结果将为石斑鱼溃疡病的防治和健康养殖提供理论依据和实践指导，减少养殖经济损失。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼

患溃疡病的珍珠龙胆石斑鱼幼鱼和用于人工感染实验的健康珍珠龙胆石斑鱼均取自厦门小嶝水产科技有限公司养殖场，充氧带回实验室。

病鱼规格7～10 cm。病鱼症状为活力较差、摄食力下降甚至不摄食、体表出血、皮肤溃烂。

健康珍珠龙胆石斑鱼幼鱼，平均体长约7 cm，平均体重约9 g，共60尾。暂养于50 L玻璃缸中，充气，水温27～28℃，盐度25，早晚各投喂一次人工配合饲料，每天换水两次，换水量为水体的1/3，暂养一周后进行人工感染实验。

1.2 病原菌分离鉴定

1.2.1 病鱼观察镜检及神经坏死病毒RT-PCR检测

观察并记录病鱼的主要病症后，取病鱼的鳃、体表黏液、病灶组织和内脏组织在显微镜下检查有无寄生虫和真菌。取眼组织，提取RNA，按照鱼类神经坏死病毒(VNN)诊断技术规程(SC/T 7216—2012)，运用RT-PCR技术检测患病鱼是否感染神经坏死病毒。

1.2.2 细菌的分离、纯化和保种

无菌取病鱼体表溃疡病灶处肌肉深部和心脏部位组织，划线接种于2216E固体培养基和TCBS培养基上，28℃ 恒温培养24 h，不同部位做好标记编号。观察菌落形态特征，挑选形态一致的优势菌进一步纯化培养。挑取纯化后优势菌株的单菌落，接种于2216E液体培养基中，28℃培养14 h后，在保种管加入0.5 mL菌液和0.5 mL 30%甘油混合，于-80℃冰箱保存保种。

1.2.3 形态学观察

取保种菌液50 μL涂布于TCBS培养基上，在 28℃ 恒温培养24 h后，挑取单菌落进行涂片、固定，革兰氏染色后镜检观察。革兰氏染色试剂盒购自南京建成科技有限公司。

1.2.4 16S rDNA鉴定

挑取单菌落放入装有10 μL ddH2O的PCR管中，99℃金属浴加热10 min， 12 000 rpm 离心5 min，取1 μL上清液作PCR模板，进行16S rDNA鉴定。PCR扩增引物为：27F( 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492R( 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反应体系为：1 μL 细菌DNA，引物各1 μL，12.5 μL 2×Taq Plus PCR MasterMix及9.5 μL ddH2O。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，30循环；最后72℃温育10 min。扩增产物经琼脂糖电泳检测后，回收目的片段送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST比对和分析，用MEGA 6.0软件采用邻接法构建系统进化树，确定所测菌株的种类。DNA marker DL2501购自上海捷瑞生物工程有限公司、PCR引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.2.5 分离菌株的生理生化测定和药物敏感性特征

生理生化的测定和药敏实验按照VITEK 2 compact 全自动微生物分析系统的标准化流程操作。使用的鉴定卡为GN(革兰氏阴性杆菌)鉴定卡和GN09(革兰氏阴性菌)药敏卡。

1.3 人工感染实验

采用腹腔注射、肌肉注射2种方法对暂养一周后的健康珍珠龙胆石斑鱼幼鱼进行人工感染实验，设置腹腔注射组、腹腔对照组、肌肉注射组和肌肉对照组，每组5尾，各设置3个平行组。菌液组每尾注射50 μL 5.4×106cfu/mL菌液，对照组每尾注射50 μL无菌生理盐水。注射后将鱼放回缸里，每天观察实验鱼的活力和摄食情况，记录每组鱼的发病症状和死亡情况。

2 结果

2.1 病症观察、镜检及RT-PCR检测结果

患病珍珠龙胆石斑鱼幼鱼体表有明显的皮肤溃烂症状(图1)，镜检未发现寄生虫和真菌；RT-PCR病毒检测结果为阴性，说明患病鱼未感染神经坏死病毒。

2.2 分离纯化

从病鱼体表病灶肌肉深处和心脏组织中均分离到细菌，且从这两个部位所分离出的优势菌落形态相似，在2216E固体培养基上分离的优势菌为白色、圆形、表面光滑、边缘规则，TCBS培养基上分离的优势菌为黄色、圆形、表面光滑、边缘规则。

2.3 细菌鉴定

2.3.1 形态学观察

革兰氏染色后镜检，发现分离菌株形态为红色、两端钝圆的短杆状(图2)，该菌株为革兰氏阴性杆菌。

2.3.2 16S rDNA鉴定

16S rDNA PCR获得1个目的片段，约1 500 bp(图 3)，将测序结果在 NCBI网站上进行 BlAST 比对分析，结果表明该菌与哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)的相似性最高，超过99%。用MEGA 6.0软件采用邻接法构建系统进化树(图4)，发现菌株HW2018与哈维氏弧菌聚为一簇，亲缘关系最近，证明菌株HW2018为哈维氏弧菌。

注：1.Marker DL2501；2.菌株HW2018扩增片段。
Notes：1.Marker DL2501；2.The amplification fragment of the strain HW2018.

2.3.3 分离菌株的生理生化特征

生理生化检测结果表明，该菌株L-脯氨酸芳胺酶、谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶、D-海藻糖、磷酸酶呈阳性(表1)。

表1 菌株HW2018的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of the strain HW2018

注：+：反应阳性；-：反应阴性。
Note：+ was positive ，-was negative.

2.4 分离菌株的药物敏感性特征

药敏分析结果显示，哈维弧菌HW2018对多种抗生素敏感，对碳青霉烯类的美罗培南、氟喹诺酮类的环丙沙星和左氧氟沙星尤为敏感，而对氨苄西林耐药(表2)。

表2 菌株HW2018的药物敏感性特征Tab.2 Antibiotic susceptibilities of the strain HW2018

注：R表示耐药，I表示中介，S表示敏感。
Note：R was presistance，I was intermediary，S was sensitivity.

2.5 人工感染实验

人工感染实验发现对照组的鱼活力和摄食情况明显比菌液组的鱼好，整个实验过程中对照组鱼摄食正常，有抢食现象，活力很好。腹腔菌液组和肌肉菌液组注射后第3天开始均有鱼死亡，一周内全部死亡，结果见表3；且腹腔注射处和肌肉注射处体表均出现发白溃烂症状(图5)。菌液注射组鱼全部死亡，发病溃烂症状与原始病鱼相似，生理盐水对照组鱼无死亡，说明菌株HW2018是珍珠龙胆石斑鱼溃烂死亡的致病菌。

表3 人工感染实验结果Tab.3 Results of artificial infection experiment

续表3

注：A.腹腔注射组；B.肌肉注射组。
Notes：A.Celiac injection group；B.Muscle injection group.

3 讨论

石斑鱼是目前福建、广东、海南等省海水养殖鱼类的主要品种之一。近年来，随着养殖环境的不断恶化，皮肤溃疡病已成为石斑鱼育苗和养殖过程中的常见疾病之一。研究表明，石斑鱼皮肤溃疡病的病原菌主要为弧菌，其中哈维氏弧菌报道的最多[2-13]。王雪惠等[9]研究表明哈维氏弧菌是天津地区海水工厂化养殖点带石斑鱼溃疡病的主要条件致病菌；崔靖等[12]对华南地区海水养殖鱼类主要弧菌病进行流行病学调查，分离到43株哈维氏弧菌，且有19株为毒力菌。许悦等[13]对海南地区养殖石斑鱼溃疡病进行调查，分离到9株哈维氏弧菌，认为目前海南地区养殖石斑鱼皮肤溃疡病的致病原有较高的同一性，主要为哈维氏弧菌。这些研究表明哈维氏弧菌已成为我国南方各地海水养殖过程中危害最大的细菌性病原[6-8，10-14]。本文分离得到的菌株HW2018经形态学、生理生化以及16S rDNA 基因序列比对，将该菌株鉴定为哈维氏弧菌，也印证了这一观点。

崔靖等调查结果表明，海南石斑鱼溃疡病的爆发时间多为4—10月[14]；许悦等调研发现，在海南地区的11—12月，养殖石斑鱼仍会发生大规模的皮肤溃疡病[13]。本文珍珠龙胆石斑鱼幼鱼溃疡病发生在1月底，与其他学者调查发现的发病时间存在差异，分析认为可能是由于该实验珍珠龙胆石斑鱼采取工厂化养殖模式，养殖密度较高所致。

通过药敏实验先确定病原菌的敏感药物种类，可以更好地防治哈维氏弧菌病，以便正确使用水产药物控制病害，避免频繁使用药物或滥用药物而引起耐药性。许悦等[13]研究表明，对哈维氏弧菌病的治疗不能仅关注于皮肤溃烂、烂尾等外观症状，应采用浸浴给药和配合口服给药的方式来对其进行系统的治疗。本研究的药敏实验表明，菌株HW2018对17种抗菌药物表现出敏感性，其中对碳青霉烯类的美罗培南、氟喹诺酮类的环丙沙星和左氧氟沙星尤为敏感，而对氨苄西林耐药。但是哈维弧菌的药敏性可能因区域、菌株类型等因素的不同而存在差异[8，10，13，15]，因此在实际养殖过程中应根据不同养殖条件进行药物选择。

哈维氏弧菌是一种条件致病菌。因此，在实际养殖过程中应以预防为主，减少鱼的搬运而避免产生体表损伤，合理规划放养密度，减少水质污染，增强鱼体免疫力，调控好水温。发生病害要迅速做出反应，在最短时间内进行治疗；被感染的鱼要及时隔离，阻止和降低溃疡病的传播。

4 结论

本实验从厦门小嶝水产科技有限公司工厂化养殖的患溃疡病的珍珠龙胆石斑鱼幼鱼中分离到一株优势菌HW2018，经过形态学、生理生化以及16S rDNA 基因序列比对，将该菌株鉴定为哈维氏弧菌。人工感染实验表明，该菌能引起健康珍珠龙胆石斑鱼幼鱼溃烂和死亡。药敏分析结果显示，哈维弧菌HW2018对多种抗生素敏感，对碳青霉烯类的美罗培南，氟喹诺酮类的环丙沙星和左氧氟沙星尤为敏感，而对氨苄西林耐药。