王刚，曹佩，韦学敏，韩建萍

中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193

DNA分子标记(DNA molecular markers)技术通过分析生物体间具有遗传信息差异的DNA片段，进而揭示生物内在基因的排布规律及其表型性状的表现规律。该技术具有速度快、灵敏度高、特异性强、准确可靠等优点，且不受生物体生长发育阶段、供试部位、试验条件等因素的影响，已广泛应用于生物体的基因组研究、遗传育种、起源进化、分类鉴定等多个领域。将DNA分子标记技术应用于药用植物种质资源的研究，可在药用植物分类及亲缘关系鉴定、道地性研究、生物多样性保护及推进中药产业现代化等各方面展示其广阔的应用前景[1-3]。目前常用的DNA分子标记技术包括限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)、随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、相关序列扩增多态性(Sequence-related Amplified Polymorphism，SRAP)、简单序列重复区间扩增多态性(Inter-simple Sequence Repeat，ISSR)、DNA条形码等[4-6]。

1 分子标记种类及优缺点

近些年来，分子标记技术迅速发展，目前已开发出几十种分子标记，并在各个领域得到了应用。广义的分子标记包括可遗传的DNA序列和蛋白质，狭义的分子标记只是指DNA标记。和以往的遗传标记相比，DNA分子标记具有以下优越性：1)不易受外界条件限制，在植物生长发育的各个阶段、各个组织中均可检测到，不受基因表达与否的影响；2)标记位点遍布整个基因组，且数量众多；3)变异在自然条件下即存在，无需创造特殊的遗传研究材料；4)不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁；5)有许多分子标记能够提供较为完整的遗传信息，可区分植物个体的纯/杂合基因型。

DNA分子标记的这些特点使其得到了广泛的应用，如种质资源遗传多样性分析、遗传图谱的构建及数量性状基因定位(QTL)、目标性状基因的标记与定位(包括质量性状和数量性状)、作物品种纯度鉴定以及品质和抗性育种等。目前，广泛用于各方面研究的分子标记主要有RAPD、SSR、AFLP、DNA条形码等[7-9]。

1.1 RFLP

RFLP是由Botsein等[11]提出的应用最早的分子标记。该标记已被应用于药用植物鉴定、亲缘关系分析、群体遗传多样性测定以及构建基因连锁图谱等方面。但RFLP技术操作复杂，耗时长，限制性内切酶的选用要求严格，且涉及到放射性物质的使用，可能对操作人员身体健康产生不利影响，这在一定程度上影响了该技术的应用[10-11]。

王雪松等[12]通过建立PCR-RFLP(聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性)指纹图谱的方法鉴定西洋参和人参，结果发现经酶切后的西洋参显示出80 bp和42 bp的两条基因片段，而人参只显示122 bp的单一片段，通过此方法可快速有效鉴定出人参和西洋参。赵仲麟等[13]利用RFLP标记对川贝母真伪性进行相对定量分析研究，结果表明含量超过10%的真品川贝母都能被稳定检测出来，且通过优化后的方法能相对定量地检测出掺假量。杜明凤等[14]利用RFLP标记分析研究淫羊藿属植物的遗传多样性，表明淫羊藿属植物的细胞质基因组之间存在微弱遗传差异，且其遗传关系与地理分布关系密切。张琼琼等[15]基于末端限制性酶切片段长度多态性(T-RFLP)技术对不同水位梯度植物的根际细菌群落多样性特征进行分析，研究结果显示，随着水位梯度的加深，植物根际细菌群落多样性呈减少趋势，不同生态型植物根际泌氧能力降低，进而抑制根际好氧细菌的生存。

1.2 RAPD

RAPD是基于PCR技术建立的检测随机扩增多态性DNA的技术。RAPD因技术简单、检测灵敏而广泛应用于药用植物的研究中。魏晓雨等[16]通过RAPD和ISSR标记技术分析不同产地西洋参的种质资源，两种标记方法得到的结果存在微小差异，但总体趋势一致；研究发现在生长环境及种植条件的影响下，东北部分产地西洋参与加拿大西洋参在遗传多样性上有所差异。徐雯等[17]基于RAPD研究分析福建产南方红豆杉遗传多样性，结果显示不同种源间的南方红豆杉存在一定的遗传变异，但不同种群间的南方红豆杉群体相似度较高，亲缘关系较近。马艳芝等[18]对来自不同产区的11份荆芥种质资源的遗传多样性进行分析，发现供试荆芥种质资源遗传差异不大，遗传基础较窄，遗传多样性不高；进一步分析出现该现象的原因可能是荆芥种质资源不同地域引种混乱，品种混杂，缺乏一定的规范与标准。刘双利等[19]利用RAPD-PCR标记分析探讨不同品种莪术的亲缘关系和遗传多样性，发现莪术群体中存在较丰富的遗传多样性，具有明显的遗传分化，这些遗传分化为莪术的种质资源筛选，高效育种和生物技术开发提供基础。

1.3 SSR

SSR又称微卫星(microsatelliet)，是一段简单的串联重复序列，广泛分布于动植物基因组中。通过率先获取SSR的侧翼序列，设计SSR引物，进一步分析找到序列中的特异保守区。当目标物种缺乏前期研究工作，无法直接得到SSR分子标记时，则需要对该物种进行分子标记的设计开发[20-21]。

朱巧等[22]对黄精属6种植物进行SSR遗传差异分析，在对60份种质资源材料进行遗传差异性和群体结构分析后，发现黄精属植物遗传多样性丰富，变异幅度大，种的界限相对模糊，互生叶系与轮生叶系的某些植物存在差异减小的现象；西部地区的植物遗传多样性高于其他地区，推测其可能是我国黄精属植物的起源中心。杨妮等[23]利用SSR分子标记分析广西莪术种质资源的遗传多样性，结果显示50份广西莪术种质材料间具有较高的遗传多样性，不同产地莪术的遗传相似系数差别较大，说明不同地区的莪术居群之间遗传分化明显；进一步将SSR扩增条带统计数据聚类分析后，对50份广西莪术种质材料进行分类，并初步确定不同材料间亲缘关系的远近。李春花等[24]利用SSR标记技术构建云南苦荞种质资源分子身份证，为云南苦荞的种质资源鉴定和保护提供依据。此外，目前已利用SSR标记技术对薄荷、百合、菊花、丹参、牡丹、黄柏等药用植物的遗传多样性和亲缘关系进行了分析研究[25-30]。

1.4 SNP

SNP标记被称作第三代DNA遗传标记，该标记可识别单个核苷酸，通过DNA序列间的细微差异区分不同个体，较之SSR多态性更高，可获得更加精确的DNA片段序列信息，对DNA严重降解的供试材料也同样适用。DNA芯片技术已被广泛用于检测SNP位点，该技术可基于已表达的基因，将与植物表型性状相关的基因与环境变化相联系，用于药用植物的道地性评价及道地性机制的研究[31-32]。

王景等[33]利用SNP分子标记技术鉴定人参品种大马牙，根据大马牙的特异SNP位点，设计特异性引物，并建立鉴定大马牙的多重PCR体系。结果显示，在多重PCR体系中，只有大马牙产生了410 bp的特异性条带，实现大马牙快速有效鉴定。王丽丽等[34]基于SNP位点对藏菖蒲及其近缘种进行鉴定，通过对藏菖蒲同属近缘种的96条ITS2序列进行分析，发现第23位和212位存在稳定的SNP位点，可准确鉴定藏菖蒲；同时研究发现藏菖蒲ITS2序列的种内变异很小，仅在158位存在一个多拷贝位点。赵俊生等[35]利用高分辨率熔解曲线对21份化橘红及3份近缘种质蜜柚和黄皮的25个SNP位点进行了基因分型，结果将全部的24份样本分为3类，化橘红种质单独聚为一类，表明SNP分子标记可有效对化橘红种质进行资源评价及品种鉴定。Li等[36]通过SNP标记对枇杷的品种多样性进行评价，新发现的SNP位点为枇杷的品种鉴定、遗传多样性分析和优质育种提供了有力的分子研究工具。

1.5 AFLP

AFLP标记技术具有分辨率高、重复性好和灵敏度高等特点，可准确有效地分析种以下水平的变异，在群体结构调查和亚种分化的研究中发挥重要作用[37]。因此被广泛地应用于遗传结构和地理位置关系的研究、遗传多样性的计算、物种起源的确定以及研究属间各种之间的关系[38-40]。

杨春勇等[41]利用AFLP和ISSR分析栽培沉香的遗传多样性，结果表明2种标记技术均能应用于沉香属植物的遗传多样性研究，2种标记的分析结果均表现出沉香属植物具有较高的遗传多样性水平；AFLP标记具有较高的多态性位点检测效率，其标记分析的遗传多样性参数高于ISSR。宋爽等[42]利用这2种分子标记分析石斛种质资源的遗传多样性，表明ISSR和AFLP标记技术都能有效地区分不同材料，且初步反映它们之间的亲缘关系；两种标记技术对石斛群体种系间关系与变异的分析结果基本一致，发现石斛群体内的分化较小，群体间的分化较大，群体间的基因流动较小。张铮等[43]利用AFLP标记研究三叶木通种质资源的遗传多样性，通过对陕西秦岭地区6个天然居群的111份三叶木通种质的分析，发现陕西秦岭地区三叶木通天然居群的遗传多样性水平较低，居群内与居群间的遗传变异程度基本相同。

1.6 ISSR

ISSR标记技术根据植物广泛存在SSR的特点，利用植物基因组本身的SSR设计引物来扩增重复序列之间的区域，无需预先对目标材料进行克隆和测序，但反应条件和实验结果易受各种因素的干扰，各反应参数都必须事先优化选择[44-45]。

赵孟良等[46]利用ISSR对来自国内外的43份菊芋种质资源进行遗传多样性分析，结果表明国内外菊芋资源间遗传关系较远，国外资源存在丰富的遗传多样性，ISSR能准确区分菊芋资源的国内外品种。Wang等[47]通过研究不同保存方法对植物样品ISSR和RAPD分子标记的影响，发现不同的保存方法对分子标记的分析结果影响较大，而保存时间对其影响较小，为根据研究对象选择合适的保存方法提供参考。Yu等[48]利用ISSR技术研究濒危药用植物厚朴的遗传多样性及亲缘关系，进一步分析厚朴种群变化、遗传进化及地理隔离之间的联系。

1.7 DNA条形码

DNA条形码(DNA barcoding)是通过利用一段短的、标准的DNA序列进行物种鉴定的分子技术。通过提取得到供试材料较为完整的DNA，利用通用引物扩增短的条形码序列，分析不同物种在该序列区域存在的差异，进而实现药用植物的快速准确鉴定。条形码技术操作简便，准确高效，得到的研究结果在不同物种之间具有可比性，推动了分子水平上物种鉴定与进化研究的快速发展。利用相对较短的基因保守序列进行物种鉴定，使分子标记技术可以得到更广泛的应用，不再受传统形态鉴定方法需依赖长期经验的局限。通过建立可视化的DNA条形码信息数据库，制定标准的实验操作流程，可使物种鉴定更加规范科学。研究人员短时间即可掌握，易于该技术的推广。这将对推动传统医药走向国际化发挥重要作用，是药用植物分子鉴定方法学上的一个巨大创新[49]。

陈士林等[50-52]在大样本量的实验研究基础上，创建了以ITS2序列为主要条形码的中药材DNA条形码分子鉴定体系，提出以ITS2为主，psbA-trnH为辅的植物类中药材DNA条形码分子鉴定指导原则。廖保生等[53]通过开发一段三七分子身份证序列，实现对三七药材、粉末的快速鉴定；韩建萍等[54]利用ITS2序列有效鉴定筋骨草及其近缘种、辛天怡等[55]利用ITS2区分当归、羌活等药材及其混淆品；此外，已通过DNA条形码技术成功实现对人参、丹参、蓼科等药用植物的快速鉴定[56-59]。为克服样品DNA降解不易进行PCR扩增的问题，Meusnier等[60]提出了“mini barcode”的概念，通过开发通用条形码序列中的部分短序列对目标物种及其近缘种进行鉴定。相关研究[61-65]在“mini barcode”的基础上提出“分子身份证”的概念，利用一段长为20～50 bp物种特异的分子标记，对目标物种进行鉴定，该方法已被用于人参、西洋参、杜仲、当归、银杏等物种的鉴定。“分子身份证”方法操作简便，适用于对DNA已降解的复杂样本的检测。

除上述几种常用的分子标记外，其他的一些分子标记技术包括SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)、STS(Sequence-Tagged Site)、SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism)、CAPS(Cleaved Amplified Polymorphism Sequence-Tagged Site)等也已在药用植物资源的各方面研究中得到了应用。此外，β-AS基因和高通量分型竞争性等位基因特异性PCR(KASP)标记技术也被用于药用植物的多样性研究、谱系地理学以及抗病性状相关的基因检测[66-68]。

分子生物学技术的快速发展，促进了众多分子标记技术的产生并广泛地应用于生物学研究的各个领域。分子标记间各有优势与不足，不同的标记技术相互结合后，又可产生新的标记技术。当前已有几十种分子标记，且各有其特点，根据不同的研究对象、目的及研究深度，研究者可进行合理选择。

2 药用植物种质资源研究现状

药用植物种质资源是保障药用植物可持续发展，进一步开发传统药物的根本，同时也是传统中医药发展的基础。当前药用植物已不仅仅局限于医药使用，而是广泛应用于保健、食用、化妆品、绿色农药等各个方面[69]。随着对药用植物资源的多元化开发利用，其社会需求在迅速增长，也由此导致了药用植物的过度损耗，生物多样性减少，野生资源严重萎缩，一些珍稀药用植物已经灭绝或濒临灭绝。因此，作为我国重要的生物资源，药用植物种质资源的收集、整理及专业保护变得尤为重要[70-72]。

表1 不同分子标记之间的比较

药用植物的生境千差万别，形态鉴别存在较大的不确定性，而采用分子标记技术能实现对植物品种快速准确地鉴定。除DNA分子标记外，等位酶技术也已被运用于药用植物资源遗传多样性的检测。但酶是基因表达的产物，而基因表达的不确定性及时空特异性，导致酶不可能在同一生物的整个生长发育阶段一直存在。另外，由于条件限制，能检测到的等位酶位点数量有限，而根据有限位点所得出的遗传多样性，不一定能代表整个基因组的实际情况。

目前药用植物种质资源研究的内容主要包括资源调查与珍稀濒危药用植物的保护、药用植物的道地性研究、药用植物的遗传多样性及分类学研究、优良品种的培育、种质资源保存技术等。因生长环境、栽培方式、采收时期与方法、药用部位、繁殖方式、播种时期等多方面因素都会对药用植物的产量和品质产生影响，故对药用植物种质资源的研究又存在一定的特殊性。因此，为保证药用植物资源的可持续利用，需进一步建立完善的药用植物种质资源保存体系，加大研究力度，培育优良品种，建立规范化种植基地，综合利用药用植物资源[73-76]。

3 分子标记在药用植物种质资源研究中的应用及前景分析

3.1 分子标记在药用植物种质鉴定与道地性研究中的应用

种质鉴定除用来在资源群体中找出真实优质的种质材料，还可以在药用植物资源的保存管理过程中，去伪存真，发现并剔除重复样品，提高保存效率。传统的鉴定方法建立在植物表型特征的基础上，以形态及显微性状观测和化学成分分析为主要研究手段。然而，对一些易混淆种、疑难种及近缘种的鉴定，传统方法往往较难得出准确的结论，且对鉴定工作者专业水平要求较高。而分子标记技术通过直接分析药用植物的遗传信息，从本质上反应各个体或群体间的差异，实现物种间的快速鉴别。此外，利用分子标记对名优道地药材的遗传信息进行比较分析，可进一步找到划分药用植物种质档次的分子标记，以促进药用植物的道地性研究[77-78]。

王丹丹等[79]采用表达序列标签微卫星标记(EST-SSR)技术对126个东北红豆杉杂交样本及其亲本基因组DNA进行了扩增，分析了杂交种与其父、母本间扩增谱带的多态性，建立了杂交种快速鉴定体系；王岚等[80]利用ISSR分子标记技术，对来自国内17个居群的285个川芎个体进行道地性分析，结果显示采自四川省内的10个川芎居群表现出更近的亲缘关系，各个川芎居群间具有较高的遗传多样性；此外，曹亮等[81]通过建立吴茱萸的RAPD分子标记技术对吴茱萸的道地性遗传背景进行分析探讨，发现不同品种吴茱萸之间遗传差异较大。

SSR、RAPD、DNA条形码等分子标记技术为中药资源的种质鉴定提供了一个新思路，且操作简单，不易受外界因素影响。分子水平的鉴定分析是一种快速有效的药用植物鉴定方法，当前已被广泛应用于药用植物种质资源鉴定及道地性研究中。此外，分子标记为药用植物道地性研究提供了新思路、新方法，进一步促进中药材道地性的机理研究。

3.2 分子标记在鉴定药用植物亲缘关系及遗传多样性中的应用

分子标记通过直接分析植物群体的DNA遗传信息，能够从本质上反映药用植物间的亲缘关系，为药用植物分类提供更加方便可靠的技术手段。此外，通过对药用植物的遗传信息进行分析比较，并建立可视化的信息数据库，绘制系统发育框图，可使药用植物资源的分类及其他相关研究更加科学规范[82]。受自然选择、迁移、突变等多种因素的影响，天然群体的基因频率会在一定的水平上波动，并直接反映在DNA水平上[83]。因此，利用DNA分子标记研究药用植物的遗传多样性和遗传结构，可以有效地揭示种群间及种群内的遗传多样性，进而分析其系统分化规律，了解基因流动趋势，为制定基因保存时的取样策略，进行种源区划以及鉴定具有生产力最佳搭配的杂交群体提供参考；同时，可促进对药用植物种质资源进化过程的进一步了解，指导开展药用植物的遗传育种及引种驯化[84-86]。

3.3 分子标记在药用植物资源与生物多样性保护中的应用

药用植物生物多样性的研究包括对生态系统、群体种类和遗传结构等不同水平上的多样性研究。其中，遗传多样性的研究是生物多样性研究的中心环节。传统的形态学和细胞学研究手段已不足以区分在不同水平下存在的多样性差异；而分子生物学的方法则可使这些差异可视化，并针对不同的药用植物群体制定有效的保护措施。采用经典的形态学分类方法研究药用植物资源，是以个体性状描述和宏观水平上的观测为基础，得到的结论往往不完善，且易引起争论；而DNA分子标记技术通过直接分析特定DNA片段在不同生物个体间存在的差异，从本质上区分不同个体或群体，使药用植物的资源学研究更加准确科学[87]。分子标记的应用有助于了解药用植物资源的进化历史、种群间关系及种群动态，从而进一步制定合理的物种保护和种群控制措施[88]。此外，利用DNA分子标记研究濒危药用植物遗传多样性，有助于评估特定居群的保护价值，并进一步制定具体、科学的濒危药用植物保护措施，包括引种栽培、迁地保护、规划自然保护区等[89]。

3.4 分子标记在遗传图谱构建及辅助育种上的应用

遗传图谱作为植物的遗传信息档案，对育种工作具有极大的参考价值。一个高密度的遗传图谱能帮助较为精准地定位到控制重要经济性状的基因，显著缩短育种年限，加快育种进程。分子标记技术的快速发展推动了植物遗传图谱的构建，在2000年前已完成了大部分重要作物的RFLP遗传连锁图。必须是通过连续几代的选择培育、系谱关系清楚的种质群体，才能用于遗传图谱的构建。但对药用植物而言，其中多数生产周期长、栽培历史短、遗传背景不明确，很难达到构建遗传图谱的条件[90-92]。宗成堃等[93]利用SSR、SRAP、和ISSR标记构建了首张丹参的遗传连锁图谱，为丹参相关数量性状的基因定位、分离以及克隆奠定了重要基础。沈奇等[94]利用SNP标记选育出具有叶籽两用、丰产、高抗、耐瘠等特性，可做绿肥使用的中研肥苏1号紫苏新品种。

3.5 分子标记在药用植物品质性状及抗病性研究中的应用

由于药用植物品种多、生长环境复杂多样，且大部分为多年生植物，导致其在生长发育过程中易受各种病害的威胁，引起产量和质量的双重下降，不利于中医药产业的健康发展。实践证明，培育优质抗病品种是控制药用植物病害、保证药用植物品质最为安全有效的措施。常规育种方法育种周期长、效率低，且易受环境因素和育种者经验的影响，尤其是药用植物病害种类繁多、鉴定复杂，更加不利于育种工作的实施。DNA分子标记技术将DNA序列信息与药用植物优质、高产、抗病等表型相关联，通过该技术研究与药用植物品质、抗病性相关的功能基因，可辅助新品种的选育、提升药用植物质量，且具有高度稳定性、准确性和高效性[95-96]。

苏建荣等[97]将RAPD标记与云南红豆杉不同器官紫杉醇含量进行关联分析，结果表明不同云南红豆杉群体间树皮、小枝和针叶的紫杉醇含量均差异显著，同时筛选出了可指示各器官紫杉醇含量的特异标记。董林林等[98]通过筛选与三七抗病相关的SNP位点，选育出与常规栽培种相比，种苗根腐病及锈腐病的发病率分别下降83.6%、71.8%的三七品种。黄静等[99]通过将番茄SSR位点与品质性状进行关联分析，找到9个与番茄总酸、成熟前果色、成熟果色、果面棱沟、番茄红素相关联的标记，为培育高品质的番茄提供理论基础。此外，陆海燕等[102]通过开发KASP标记位点成功区分玉米的杂种优势群。Zhao等[100]通过SSR标记从120个葡萄品种中筛选出抗霜霉病品种。Feng等[101]利用SSR找出与丹参酚酸含量相关的QTL位点。付必胜等[103]开发了与小麦抗白粉病基因Pm48紧密连锁的分子标记。张鹏等[104]利用特异性位点扩增片段测序(SLAF-seq)技术开发黄瓜白粉病抗性分子标记。卿冬进等[105]利用抗稻瘟病基因Pigm序列与其等位基因Pi2、Pi9及感病品种中等位基因的序列差异，结合PARMS技术(Penta-primer amplification refractory mutation system)，建立Pigm基因的荧光分子标记。陈大霞等[106-107]利用目标起始密码子多态性(SCOT)标记将8个黄花蒿品种聚为2类，并通过相关序列扩增多态性(SRAP)标记了青蒿素含量较高的4个产地的黄花蒿之间的多态位点，有利于品种选育过程中有益基因的相互渗透。Asghari等[108]也利用特征性片段扩增区域(SCAR)标记筛选出蒿属植物中青蒿素含量较高的品种。因此，通过分子育种的方法，结合表型和基因型，可缩短育种年限，提高育种效率，并筛选出优质、高产、抗性强的药用植物新品种。

4 展望

综上所述，DNA分子标记技术在药用植物种质资源与道地性评价、亲缘关系研究及品种与真伪鉴定等领域已得到广泛应用。药用植物种质资源是中医药产业发展的基础，对其深入研究是培育优良品种、保障药用植物产量和质量、生产优质中药材的前提条件。另一方面，药用植物种质资源的遗传多样性研究又是遗传图谱构建、基因定位及标记等技术的基础。因此，应用DNA分子标记技术对药用植物种质资源的各个方面进行深入研究是推动我国中医药行业发展、实现中药材生产现代化的重要举措。但无论是在广度还是深度上，当前药用植物研究所涉及的分子标记类型仍有不足，且存在较大的发展空间。以后的研究可从以下几方面着手：1)研究开发更多、更高效的分子标记技术，筛选出具有高多态性的引物和探针；2)开发新型分子标记技术，构建对应的分子标记连锁图谱；3)建立表型与基因型相关联的遗传信息数据库，推动开展分子设计育种。伴随着基因组学和生物信息学等学科的快速发展，DNA分子标记必将在药用植物研究中得到更加广泛的应用，利用分子标记技术构建药用植物的遗传连锁图谱，开发药用植物重要品质性状的分子标记，开展种质资源遗传信息和有效成分相关性的研究，必将成为今后药用植物分子标记辅助育种研究的重点。