李京伟，姜小艳，陈玉琴，吴海滨，李海文，李 健，黄 彬*

(1.深圳市中医院,广东 深圳518033;2.广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳518033)

胃癌作为癌症死亡的第二大原因，每年均有大量的新发病例，在这些新发病例中近三分之二发生在发展中国家，它与饮食，生活水平和医疗条件等密切相关[1]。 在中国，胃癌是最常见的癌症之一，已成为城市中癌症引起死亡的主要原因[2]。晚期胃癌患者的预后较差，复发率较高，深入研究胃癌发病、发展的分子机制，对于胃癌的预防和治疗具有重要意义[3]。富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(Leucine-rich Repeat Containing G Protein-coupled Receptor 5，Lgr5，又名 GPR49)，为Wnt/β-catenin信号通路的靶基因Lgr5编码，Lgr5+细胞具有多向分化潜能，与多种消化道肿瘤的进展及预后关系密切，但Lgr5促进肿瘤发生、发展的具体机制尚未完全阐明[4,5]。本研究通过检测不同分化程度胃癌临床组织样本和细胞系中相关蛋白的表达，探索Lgr5与Wnt/β-catenin通路在胃癌进程中表达变化及其作用，为胃癌的基因治疗提供潜在的治疗方法和靶点。

1 材料与方法

1.1 临床样本收集与细胞培养30例胃癌组织和10例正常胃黏膜组织标本，来自于深圳市中医院，所有参与者均已签署书面知情同意书。样本经临床和组织病理学诊断，根据日本胃癌协会[6]的标准，分为三种类型：低分化胃癌，中分化胃癌和高分化胃癌，每种类型10例。手术切除获得的临床样品，部分立即固定在4%多聚甲醛溶液中，部分新鲜冷冻在液氮中并储存在-80℃下用于PCR测定。人胃正常黏膜上皮细胞GES-1，人未分化胃癌细胞株HGC-27， 人低分化胃癌细胞株BGC-823，人中分化胃癌细胞株MGC-803和人高分化胃癌细胞株AGS购自上海细胞库，均培养于10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃ 5% CO2培养箱中培养。本研究经过深圳中医院机构审查委员会批准。

1.2 qRT-PCR检测组织样本经液氮研磨Trizol提供总RNA，细胞样本用Trizol直接提取总RNA。以提取的总RNA为模板，逆转录成cDNA；按照qRT-PCR试剂盒SYBR Green法步骤进行扩增，扩增42个循环周期，每个样本重复3次，并以β-actin基因为内参，3次独立实验后得到的数据运用相对表达量(Relative quantification，RQ)公式RQ=2-ΔΔCt的方法进行分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 Western blot检测组织样本经机械破碎后，蛋白裂解液提取总蛋白，细胞样本直接提取总蛋白。BCA法检测总蛋白浓度，计算并确定上样量，进行SDS-PAGE电泳，条件为浓缩胶60 V电泳60 min，分离胶120 V电泳70 min。湿转法转膜，条件为100 V，60 min；5%BSA封闭60 min后，分别进行一抗(Abcam,USA)和二抗(博奥森，中国)孵育，洗涤3次后，ECL化学发光，X线底片显影。采用Image J软件分析蛋白的表达量。

1.4 免疫磁珠法分选Lgr5-和Lgr5-细胞胰酶消化收集AGS细胞，加入10 μl Lgr5抗体孵育20 min；PBS洗涤后，磁珠缓冲液重悬细胞并加入40 μl免疫磁珠孵育20 min，PBS洗涤后，重悬细胞移入到分离柱中，收集流出液体，得到Lgr5-细胞；将分离柱移出磁场，加入分选缓冲液分选得到Lgr5+细胞。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖活性分别取分选的Lgr5+和Lgr5-细胞，消化收集并计数，接种于96孔板内，5×103个/孔，5%CO2，37 ℃分别培养0、24、48和72 h后，每孔加入10 μl CCK-8检测试剂(碧云天，中国)，置于培养箱继续培养1 h，在酶标仪OD450 nm处测量各孔的吸光度值。每个时间点设5个复孔，实验重复3次。

1.6 细胞侵袭实验分别取分选的Lgr5+和Lgr5-细胞，消化收集并计数，将1×105个细胞接种于Transwell小室上室，上室加入无血清培养基，下室为含10%胎牛血清的培养基。培养48 h后弃掉培养基，用PBS清洗两次，4%多聚甲醛固定15 min后，0.5%结晶紫染色20 min，棉签刮掉上室内的细胞，在倒置显微镜下随机读取5个视野观察并计数。

2 结果

2.1 不同分化程度临床胃癌组织和细胞样本中Lgr5、β-catenin、 c-MYC和MMP-7 的表达情况

qRT-PCR和Western blot分析结果显示(图1和图2)，正常组(正常胃黏膜组织)，低分化、中分化和高分化胃癌组织中Lgr5、β-catenin、 c-MYC和MMP-7 mRNA及其蛋白表达水平依次升高，其中，中分化和高分化胃癌组织与正常组相比具有显著性差异(均P<0.05)。对于GES-1，HGC-27，BGC-823，MGC-803和AGS细胞而言，其Lgr5、β-catenin、 c-MYC和MMP-7 mRNA及其蛋白表达水平亦依次升高，但仅中分化的MGC803和高分化的AGS细胞与人胃正常黏膜上皮细胞GES-1相比具有显著性差异。Lgr5、β-catenin、 c-MYC和MMP-7表达情况在成熟人胃癌细胞株和临床胃癌组织样本中相一致。

图1 qRT-PCR检测不同分化程度临床胃癌组织(A)和细胞样本(B)中Lgr5、β-catenin、 c-myc和MMP-7 mRNA表达水平

图2 Western blot检测不同分化程度临床胃癌组织(A和C)和细胞样本(B和D)中Lgr5、β-catenin、 c-myc和MMP-7蛋白表达水平

2.2 Lgr5+细胞和Lgr5-细胞的增殖活力检测结果

Lgr5+细胞和Lgr5-细胞的增殖活力检测结果见图3，在起始细胞数量相同的情况下，经过一段时间的培养，Lgr5+细胞的OD值明显高于Lgr5-细胞，表明了此时Lgr5+细胞的数量明显高于Lgr5-细胞，说明了Lgr5+细胞的增殖活力显著高于Lgr5-细胞。

2.3 Lgr5+细胞和Lgr5-细胞的侵袭能力检测结果

Transwell小室检测结果显示，Lgr5+细胞组细胞的侵袭数量明显多于Lgr5-细胞组，见图4。 对5个视野观察并计数的结果显示，Lgr5+细胞组发生侵袭的细胞数量为145.00±13.64，Lgr5-细胞组为51.80±7.05，差异有统计学意义(表2，P<0.05)。

图3 CCK-8检测Lgr5+ 细胞和Lgr5-细胞的增殖活力

图4 Transwell法检测Lgr5+ 细胞和Lgr5-细胞的侵袭能力(结晶紫染色，×400)

表2 Lgr5+ 细胞和Lgr5-细胞的侵袭数量统计结果

2.4 Lgr5+细胞和Lgr5-细胞中β-catenin、 c-MYC和MMP-7 的表达情况

qRT-PCR和Western blot分析结果显示(图5)，Lgr5+细胞组Lgr5、β-catenin、 c-MYC和MMP-7 mRNA及其蛋白表达显著高于Lgr5- 细胞组(均P<0.05)。

图5 qRT-PCR和westen blot检测Lgr5+ 细胞和Lgr5-细胞中β-catenin、 c-MYC和MMP-7 mRNA(A)和蛋白(B)表达水平

3 讨论

β-catenin是Wnt信号通路的核心物质，其在胞核中累积是Wnt信号激活的标志，作为一种粘连蛋白，其高表达可促进肿瘤细胞的转移和侵袭性生长，与多种肿瘤的不良预后相关[7,8]。c-MYC是Wnt通路的第二个靶体，β-catenin移位进入细胞核后与Tcf/Lef家族中的转录因子发生反应，β-catenin/Tcf复合体激活靶基因c-MYC和cyclinDl等，使细胞异常增殖与分化，最终导致肿瘤的形成与发展[9]。MMP-7属于基质金属蛋白酶家族的成员，具有强大的基质降解活性和底物特异性，在各类肿瘤的复发转移中均可见其过度表达[8-11]。本研究，通过对不同分化程度的胃癌组织和细胞系分析发现，β-catenin，c-MYC和MMP-7的表达水平随着分化程度的升高而升高，高分化的胃癌细胞表现出更高水平的Wnt/β-catenin通路激活，导致肿瘤细胞的粘连性下降，最终发展为侵袭性生长和远处转移，这是肿瘤复发的主要原因。

Lgr5，作为Wnt信号通路的靶基因，主要表达于腺窝基底的柱状细胞上，被认为是癌症干细胞标志物之一[12]，其阳性表达患者预后较差，平均生存期较短，Lgr5 的表达水平可在一定程度上预测肿瘤的治疗效果及预后[13]。Wnt通路异常激活可引起Lgr5表达水平的变化，从而对细胞的增殖分化和肿瘤的发生和发展起到重要作用。Choi YJ等人指出，Lgr5 可能是通过增强Wnt/β-catenin信号促进胃癌肿瘤血管的形成，最终加快胃癌进程[14]。Simon E等人通过对100例原发性胃癌患者临床样本进行定量RT-PCR和免疫组织化学染色发现胃癌组织中Lgr5 mRNA平均表达水平是正常组织的5倍，与β-catenin表达具有正相关性，在非肿瘤组织中仅分布有极少数的Lgr5+细胞[15]。本研究通过免疫磁珠法，分选出AGS细胞中Lgr5+和Lgr5-细胞，对其分别进行增殖和侵袭能力比较发现，Lgr5+细胞具有更强的增殖和侵袭能力，与上述研究结果一致，这说明Lgr5的表达水平可在一定程度上预测肿瘤的治疗效果及预后。

综上所述，Lgr5与Wnt/β-catenin在胃癌进程中发挥着重要作用，可作为胃癌临床监控的标志物。Lgr5的高表达以及Wnt/β-catenin通路的异常激活可促进胃癌的恶化和复发，而人为降低Lgr5表达，抑制Wnt/β-catenin通路激活，可能是胃癌基因治疗的方法之一。