王汉海　曹慧　隋美霞　万永霞　高顺航

摘要：建立小鼠急性溶血性贫血模型并观察中药组方溶宁的治疗效果，测定模型小鼠外周血和骨髓组织结构的变化。将32只小鼠随机分为空白对照组、模型组、试验对照组和试验组，连续进行血常规检测以及石蜡切片和超微切片观察。结果表明，中药组方溶宁可改善外周循环血及骨髓细胞的超微结构，对溶血性贫血有一定的防治效果。

关键词：溶宁;溶血性贫血;小鼠;骨髓

中图分类号：R285         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）22-0149-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.035           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Influences of Chinese drugs rongning preparation on peripheral blood and bone marrow of mice with hemolytic anemia

WANG Han-hai，CAO hui，SUI Mei-xia，WAN Yong-xia，GAO Shun-hang

（Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology in Universities of Shandong Province/College of Bio-engineering and Agriculture，Weifang University，Weifang 261061，Shandong，China）

Abstract： To explore the mechanism of effect of Chinese drugs rongning preparation on hemolytic anemia mice by determination of the peripheral blood and bone marrow tissue structure. 32 kunming mice were randomly divided into blank control group， model group， control group and experimental group. The results showed that the rongning preparation can improve the peripheral blood and the ultrastructure of bone marrow cells， and have a precise curative effect on treating preventable hemolytic anemia through paraffin section method and continuous determination of the blood routine.

Key words： rongning; hemolytic anemia; mice; bone marrow

多種理化因素都可以诱发溶血性贫血（Hemolytic anemia，HA）[1]。利用盐酸苯肼建立了小鼠急性HA模型[2，3]，方剂溶宁包括柴胡、黄芩、茵陈、半枝莲等，观察了在溶宁制剂和强的松的干预下，模型鼠外周血各项指标的改变和骨髓的形态学改变。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  试验动物  试验动物为昆明小鼠，鼠龄8周，体重（22±3） g，由潍坊学院动物中心提供，雌雄随机，试验前适应性饲喂3 d。

1.1.2  试剂  瑞氏色素为美国Sigma产品;盐酸苯肼由上海化学试剂采购供应站出品;溶宁制剂中药材购于潍坊市人民医院中药房。

1.2  方法

1.2.1  溶宁制剂的制备  取雷公藤、茵陈、半枝莲各15 g，柴胡、半夏、黄芩、甘草各10 g，党参12 g[4，5]，洗净后用500 mL自来水浸泡30 min，煮沸后文火煎煮20 min成200 mL汤剂;另加自来水400 mL煮沸后文火煎煮15 min成150 mL汤剂，两次汤剂混合三层纱布过滤后文火至191.7 mL，其浓度为0.506 g/mL，置于4 ℃备用。溶宁制剂的临床口服用量为1.386 g/kg（5.48 mL/kg），按照人与小鼠的剂量换算系数0.002 6[6]，模型鼠用量为1.386 g/kg×70 kg×0.002 6=0.253 g，故试验时取0.506 g/mL溶宁制剂0.5 mL饲喂即可。

1.2.2  试验分组  试验用昆明小鼠共32只，随机分为4组，每组8只。空白对照组：皮下注射生理盐水（按3.3 mL/kg体重），喂服生理盐水0.5 mL（每天处理1次，下同）;模型组：皮下注射0.1%盐酸苯肼生理盐水液（按3.3 mL/kg体重），喂服生理盐水0.5 mL;试验对照组：皮下注射0.1%盐酸苯肼生理盐水液（按3.3 mL/kg体重），喂服强的松0.2 mL;试验组：皮下注射0.1%盐酸苯肼生理盐水液（按3.3 mL/kg体重），喂服溶宁制剂0.5 mL。

1.2.3  切片制作  分别于第2、4、6、8、10天每组随机选取2只小鼠，取骨髓中性甲醛固定，断尾检测外周血;第10天处死后取骨髓部分用戊二醛和锇酸双固定制备超薄切片，剩下用中性甲醛固定制备石蜡切片。

1.2.4  外周循环血象观察  75%乙醇溶液消毒后毛细吸管断尾取血，红、白细胞计数，测定红蛋白（Hb）含量和网织红细胞（Retc）比值。

1.2.5  光镜和透射电镜样品[7]的制备  试验第10天断头处死小鼠后剪断后肢，纱布擦净肌肉和结缔组织，用1 mL注射器生理盐水小心冲出骨髓，中性甲醛固定，常规制作石蜡切片，HE染色后显微图像采集分析系统（Scopeimage 9.0）整理分析图片;另戊二醛、锇酸双固定，醋酸双氧铀及硝酸铅染色，H-7500型透射电镜下观察并采集图片。

1.2.6  统计学分析  所有数据以x±s表示。用Nosa统计软件进行方差分析，并进行Dunnett-t检验[8]，检验水准为α=0.05，以P<0.05为差异显著，具有统计学意义。

2  结果与分析

2.1  血液学指标的改变

试验组与模型组比较，血常规中的红细胞数和Hb含量升高，Retc比值降低，经统计学分析有显著性及极显著性差异（P<0.05和P<0.01）;与试验对照组比较，试验组对血常规影响无显著性差异（P>0.05）。且Retc比例随苯肼用量的增加呈增大趋势，但试验组和试验对照组Retc比例增高程度明显小于模型组，且在用药第8天开始有降低趋势，而除空白对照组外，循环血白细胞数量都有明显增加[3，9]（表1至表4）。

2.2  中药组方溶宁对骨髓细胞形态的影响

2.2.1  光镜观察结果  光镜下模型组骨髓内见大小不等、形状异常的成熟红细胞（图1A），试验组（图1B）和试验对照组（图1C）成熟红细胞碎片较少，形态相近。

2.2.2  电镜观察结果  透射电镜下空白对照组幼稚红细胞、中幼红细胞核糖体和线粒体较多，核仁明显;骨髓血窦内皮细胞较完整，窦腔内有较多红细胞（图2A）。模型组幼稚红细胞表面突起较少，胞质内线粒体呈空泡样变和髓样变，血窦内皮细胞局部断裂，微绒毛较少，核周隙局部增宽（图2B）。试验对照组（图2C）和试验组（图2D）幼稚红细胞接近正常，血窦内皮细胞较完整，试验对照组的内皮细胞表面微绒毛最多。

3  讨论

方中柴胡和解表里，黄芩、茵陈清湿热，党参补气血，组方主要有清湿热、和脾胃、解表里、舒肝解瘀、补气养血等功效[9]。内在缺陷或外部因素都可破坏膜稳定性使红细胞崩溃造成HA，强的松可增加红细胞膜稳定性，降低HA的程度，使用溶宁制剂后循环血Retc比例降低，红细胞数量和Hb含量降幅减小，说明溶宁制剂在增加膜稳定性、刺激骨髓红细胞系统或加速Hb的生成等对抗HA方面有一定作用。同时，通过白细胞计数发现，除空白对照组外，其他各组白细胞数量都明显升高，尤其表现在试验的第6～8天，这种现象在其他文献中报道较少，很可能是盐酸苯肼的毒性作用所致。在试验后期，白细胞数量有所下降，也说明强的松的抗炎作用和溶宁制剂在清湿热、解毒方面的作用。

光镜下正常骨髓组织内见大量粒细胞和成熟红细胞;模型组显示大量大小不等、形状异常的成熟红细胞，并可见红细胞碎片;试验组和试验对照组成熟红细胞碎片较少，形态接近正常，说明盐酸苯肼对髓内红系细胞产生毒性作用[11]。

透射电镜下空白对照组可见正常原红细胞和中幼红细胞，细胞器边缘清晰，无脱颗粒现象;毛细血管表面可见大量微绒毛，内皮细胞连续[12]。与空白对照组相比，模型组骨髓中红细胞碎片增多，早幼红细胞有线粒体受损现象，线粒体嵴模糊不清，中幼红细胞线粒体电子密度增大，粗面内质网出现脱颗粒以及异染色质增多的现象。线粒体密度、大小及嵴的丰富程度能直接反映细胞的生理功能状态，粗面内质网脱颗粒后会出现蛋白质合成及运输障碍，电镜检测结果说明盐酸苯肼可使红细胞受损。试验对照组和试验组在透射电镜下形态差别不大，骨髓内红细胞大多正常，中幼红细胞内出现多聚核糖体，毛细血管表面见大量微绒毛，内皮细胞核周隙增宽现象不明显，仅有少数出现空泡样变，说明强的松和溶宁对骨髓的形态学改变与空白对照组比有较大改善。

参考文献：

[1] 张之南，沈  悌.血液病诊断及疗效标准[M].第二版.北京：科学出版社，1998.

[2] 王汉海.改良溶血性贫血动物模型的建立[J].安徽农业科学，2010，38（34）：19533-19536.

[3] 张  宁，史学娟.简便、准确的网织红细胞直接计数法[J].中华临床医学研究杂志，2005，11（5）：723.

[4] 史大卓.中医内科辩证治疗学[M].北京：科学技术出版社，1995.

[5] 黄才燮.常用中草药识别与应用[M].北京：化学工业出版社，2003.

[6] 辛先贵，张圣明，张春燕，等.中药露蜂房蛋白对人红白血病细胞株K562细胞影响的试验研究[J].中国药理学通报，2005，6（12）：6-9.

[7] 李伯勤，张圣明.医学超微结构基础[M].济南：山东科学技术出版社，2003.

[8] 王汝芬，陈景武，李建国，等.医药科学研究统计方法[M].济南：山东科学技术出版社，1994.

[9] 黄才燮.常用中草药识别与应用[M].北京：化学工业出版社，2003.

[10] 王汉海，万永霞.中药组方溶宁对急性溶血性贫血小鼠模型外周血及肝脏、脾脏的影响[J].黑龙江畜牧兽醫，2017（1）：195-197，298.

[11] 万永霞，王汉海.甲醛对小鼠造血功能影响的试验研究[J].湖北农业科学，2013，52（16）：3905-3907.

[12] 张圣明，李建华，崔为法，等.慢性再生障碍性贫血患者骨髓细胞形态的透射电镜观察[J].中华血液学杂志，1990，11（5）：253-254.