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武汉地区禽大肠杆菌的分离、鉴定与耐药模式探讨

2019-12-23邵志勇陈夏冰杨文海何斌吴利军聂文豪金尔光陈洁李佳琳张翠丽

湖北农业科学 2019年22期
关键词:分离鉴定大肠杆菌

邵志勇 陈夏冰 杨文海 何斌 吴利军 聂文豪 金尔光 陈洁 李佳琳 张翠丽

摘要:为了解武汉地区禽大肠杆菌(Escherichia coli)对常用抗生素的耐药情况,采集疑似患病病鸡进行大肠杆菌分离与鉴定,并对分离菌株进行药物药敏性分析。结果表明,从武汉地区11个养殖场115份样品中分离到55株大肠杆菌,对青霉素(P)、氨苄西林(AMP)的耐药率达到100%;对头孢拉定(CED)、链霉素(STR)、氯霉素(C)、氟苯尼考(FFC)、四环素(TET)的耐药率超过80%;对头孢吡肟(FEP)、庆大霉素(GEN)、左氧氟沙星(LEV)最为敏感,耐药率低于10%。55株大肠杆菌有12种耐药谱,多重耐药率高达94.55%,3重耐药菌株占比为50.91%。

关键词:禽;大肠杆菌(Escherichia coli);分离鉴定;耐药模式

中图分类号:R378.2+1         文献标识码:A

文章编号:0439-8114(2019)22-0141-04

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.033           开放科学(资源服务)标识码(OSID):

Isolation and identification of avian Escherichia coli and its drug

resistance model in Wuhan district

SHAO Zhi-yong1,CHEN Xia-bing1,YANG Wen-hai1,HE Bin1,WU Li-jun1,NIE Wen-hao2,

JIN Er-guang1,CHEN Jie1,LI Jia-lin3,ZHANG Cui-li3

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Sciences,Wuhan Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430208,China;

2.Hubei Quansheng Ecological Agricultural Development Co.,Ltd.,Tianmen 431728,Hubei,China;

3.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

Abstract: In order to grasp the resistance of E. coli to common antibiotics in Wuhan district, the suspected diseased chicken samples were collected for E. coli isolation and identification, and the drug isolates were analyzed for drug sensitivity.The results showed that 55 strains of E. coli were isolated from 115 samples from 11 farms in Wuhan, and their resistance rates to penicillin (P) and ampicillin (AMP) reached 100%; for cefradine (CED) and streptomycin (STR), chloramphenicol (C), florfenicol (FFC), tetracycline (TET) resistance rate of more than 80%; for cefepime (FEP), gentamicin (GEN), levofloxacin (LEV). The most sensitive, the resistance rate is less than 10%. There were 12 drug resistance profiles in 55 strains of E. coli, and the multi-drug resistance rate was as high as 94.55%, among which 3 resistant strains accounted for 50.91%.

Key words: avian; Escherichia coli; isolation and identification; drug resistance pattern

禽大腸杆菌病是由致病性大肠杆菌(Escherichia coli)引起的禽类下痢、呼吸道感染和败血症等多种临床表现的疾病。较常见的病症有腹膜炎、输卵管炎、心包炎、肝周炎、气囊炎等。自1894年Ligniers首次报道了鸡大肠杆菌病,世界养禽发达国家和地区相继对该病不同病型进行了报道[1]。随着集约化养禽业的迅速发展,致病性大肠杆菌对养禽业所造成的损失日益显著[2]。

长期以来大肠杆菌病主要依赖抗菌药物进行防控。抗菌药物长期、大量的使用,导致大肠杆菌的耐药菌株不断出现,耐药性不断加强,耐药谱不断扩大,增加了对禽大肠杆菌病的防控难度。本研究对武汉地区疑似患大肠杆菌病的家禽进行大肠杆菌分离与鉴定,并对其进行药物敏感性试验,以了解禽大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药情况,为指导禽大肠杆菌病的临床用药提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  病料来源  病变样品采集于武汉地区疑似患大肠杆菌病家禽的病变组织。

1.1.2  主要药品与试剂  青霉素(P)、氨苄西林(AMP)、哌拉西林(TZP)、头孢他啶(CAZ)、头孢哌酮(CFP)、头孢吡肟(FEP)、头孢噻肟(CTX)、头孢曲松(CRO)、头孢拉定(CED)、头孢氨苄(LEX)、庆大霉素(GEN)、链霉素(STR)、卡那霉素(KAN)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、诺氟沙星(NOR)、洛美沙星(LOM)、氯霉素(C)、氟苯尼考(FFC)、四环素(TET)药敏片购自杭州微生物试剂有限公司。

麦康凯琼脂培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司,伊红美蓝琼脂(EMB)、MH营养琼脂、大肠杆菌生化鉴定试剂盒购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.2  方法

1.2.1  引物的设计与合成  根据GenBank中大肠杆菌phoA基因序列,使用Oligo7.0软件设计通用引物,序列为phoA-F 5-CGATTCTGGAAATGGCAAA

AG-3,phoA-R 5-CGTGATCAGCGGTGACTATGA

C-3,引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。

1.2.2  菌株的分离纯化与生化特性鉴定  在无菌条件下,挑取疑似感染大肠杆菌的家禽病变组织接种于麦康凯琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基进行细菌分离,对分离纯化的菌株进行革兰氏染色与镜检,观察细菌形态;同时,利用大肠杆菌生化鉴定试剂盒进行生化特性鉴定。

1.2.3  PCR鉴定  对分离菌株进行菌液PCR鉴定,反应条件为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30个循环;72 ℃延伸10 min后16 ℃保存。预期扩增片段大小为720 bp,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像仪上观察并记录电泳结果。

1.2.4  药敏试验  药敏试验根据美国临床标准委员会(NCCLS)推荐的K-B琼脂法进行。取待测菌株,涂布于麦康凯琼脂培养基复苏,挑取单个菌落接种于无菌TSB液体培养基,37 ℃恒温摇床培养,与麦氏比浊管0.5比浊相同(菌液计数约1.5×108 CFU/mL)时,吸取100 μL菌液,用无菌三角推均匀涂布于MH平板上,每个平板贴5张药敏试纸片,37 ℃恒温箱培养16~20 h后,观察并记录。根据2018CLSI M100-ED28标准进行药物敏感性结果判定,见表1。

根据多重耐药(MDR)、泛耐药(XDR)、全耐药(PDR)多重耐药菌暂行标准[3],从6类抗菌药物中各选出1种代表药物,分别为P、CAZ、GEN、CIP、 C、TET,依據耐药情况形成菌株多重耐药谱进行多重耐药菌株的判断。

2  结果与分析

2.1  菌株的分离纯化与生化特性鉴定结果

从115份样品中分离到55株疑似大肠杆菌菌株,分离菌株在麦康凯琼脂平板上形成粉红色、圆形、隆起、光滑湿润、边缘整齐的中等大菌落(图1a);在伊红美兰琼脂培养基上形成黑色菌落并带有金属光泽(图1b)。革兰氏染色镜检可见形态为红色、两端钝圆的短杆菌,分离菌株为革兰氏阴性菌(图2)。

55株菌株在生化鉴定中都能发酵葡萄糖,能分解麦芽糖、乳糖、甘露醇、尿素;部分能够分解蔗糖;吲哚试验阳性,MR试验阳性,VP试验阴性,不产生H2S,不能利用枸橼酸盐;所有分离菌与大肠杆菌的生化特性相符。

2.2  PCR鉴定结果

对55株分离菌进行PCR扩增,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,扩增目的条带大小与预期片段一致,初步判定为大肠杆菌。部分菌株PCR扩增结果如图3所示。

2.3  药物敏感试验

55株大肠杆菌对20种常见抗菌药物敏感性结果见表2。由表2可知,55株大肠杆菌对P、AMP的耐药率最高,达100%;对CED、STR、C、FFC、TET的耐药率超过80%;对FEP、GEN、LEV较为敏感,耐药率为10%以下。

2.4  禽大肠杆菌对6类抗菌药物的耐药谱

55株禽大肠杆菌耐药谱有12类型,多重耐药(3重及以上耐药)率达94.55%(52/55)。其中,3重耐药菌株占比最大,比例为50.91%(28/55),以P-GEN-TET耐药谱占比最高,为21.82%(12/55)(表3)。

3  讨论

大肠杆菌广泛存在于自然界中,作为一种常在菌,当外界环境改变时,可引发大肠杆菌病的暴发,对养殖业将会造成严重的经济损失。长期以来,大肠杆菌病主要依赖抗菌药物进行防控,70%兽用抗菌药物被用作饲料添加剂,导致大肠杆菌的耐药菌株不断出现,耐药性不断增强,耐药谱不断扩大,以至于发病导致无药可用[4]。

55株禽大肠杆菌对20种常用抗菌药物存在不同程度的耐药,头孢菌素类(CED除外)、喹诺酮类耐药率较低,青霉素类、氨基糖苷类(GEN除外)、酰胺醇类、四环素类耐药率较高,其中酰胺醇类、四环素类抗菌药物的耐药率菌高于80%,与刘华栋等[5]和韦庆兰等[6]对禽源大肠杆菌耐药率的分析基本一致。此外,本试验PG的耐药率达到100%,但王晓姗等[7]研究结果表明,禽大肠杆菌对PG存在较高的敏感,与本试验结果相反。刘璨颖等[8]对禽源致病性大肠杆菌的耐药结果分析发现,大肠杆菌对CRO、GEN、CIP、NOR、LOM耐药率较高,与本试验中上述药物的耐药率较低,存在一定差异。大肠杆菌对多种抗菌药物存在普遍耐药,且耐药率较高,可能是在养殖过程中滥用各类抗菌药物,导致有效抗菌药物越来越少;但个别抗菌药物的使用其结果不尽相同,只是针对当地的大肠杆菌敏感,其他区域可能对该药耐药,分析原因可能是地域差异造成的。

本试验中大肠杆菌对6类抗菌药物的耐药谱进行了分析,多重耐药率高达94.55%,多重耐药情况严重,其中以耐3~4种药物的菌株为主。王佳等[9]对120株鸡源大肠杆菌进行药敏试验,多重耐药率高达100%,其中耐17种药物的菌株占比为20.78%;马建山[10]对82株鸡源大肠杆菌进行耐药试验,多重耐药率高达89.02%,其中耐4种药物的菌株最多为31.70%,与本试验的多重耐药率接近。说明禽大肠杆菌耐药情况比较严重,存在多重耐药谱且耐药谱复杂,临床可选药物越来越少,对大肠杆菌的防控越来越严峻。因此,指导抗菌药物的科学使用,促进家禽养殖业向可持续性方向发展,保障人民身体健康具有重大意义。

参考文献:

[1] 马兴树,范翠蝶,夏玉龙.禽致病性大肠杆菌病研究进展[J].中国畜牧兽医,2013,40(2):169-174.

[2] 马兴树.禽传染病实验室诊断技术[M].北京:中国化工出版社,2006.

[3] MAGIO RAKOS A P,SRINIVASAN A,CAREY R B,et al.Multidrug-resistant,extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria:An international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance[J].Clin Microbiol Infect,2012,18(3):268-281.

[4] 陳敬雄,岳建雄.养殖业抗生素使用现状及其对策[J].中国畜牧兽医文摘,2013,29(5):15-16.

[5] 刘华栋,唐  娟,李婷婷,等.山西地区鸡源性大肠杆菌分离株药物敏感性分析[J].黑龙江畜牧兽医,2018(5):132-135,266.

[6] 韦庆兰,张济培,任  涛,等.广东地区水禽源大肠杆菌药物敏感性分析[J].黑龙江畜牧兽医,2015(12):180-181.

[7] 王晓姗,李斯亮.禽大肠杆菌的分离与耐药性分析[J].畜牧兽医杂志,2018,37(6):21-23.

[8] 刘璨颖,李建宏,梅启定,等.禽源致病性大肠杆菌的耐药性和毒力基因研究[J].中国家禽,2018,40(13):21-25.

[9] 王  佳,于  杰,邹  玲,等.潍坊某鸡场大肠杆菌耐药性及血清型检测[J].黑龙江畜牧兽医,2018(22):105-107.

[10] 马建山.大连地区禽源大肠杆菌的分离、鉴定及药物敏感性试验[J].黑龙江畜牧兽医,2018(10):92-94.

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