刘青青

摘 要 在发育生物学和神经生物学研究领域，小鼠原代海马神经细胞都是极为重要的细胞材料。它可用于关键基因及蛋白表达分析、线粒体功能及电生理研究，为神经系统的发育及相关疾病的发生发展提供理论依据。本研究旨在建立一种高效稳定的小鼠海马神经细胞的分离和培养方法。

关键词 海马神经细胞 原代细胞培养 C57BL/6J小鼠

中图分类号：R394.2文獻标识码：A

体外培养的神经细胞具有不受体内因素干扰，易于观察和造模等优点，目前被广泛应用于神经退行性疾病、缺血性脑血管疾病等神经系统相关疾病的研究。海马神经细胞包含了神经细胞的大部分类型，体外培养过程中能形成广泛的树突连接。分离提取小鼠海马神经细胞不仅能达到较高的细胞纯度，且神经细胞具有较高的一致性。但是由于神经细胞是高度分化的细胞，体外培养生长缓慢且不能传代，因此掌握一种高效稳定地分离培养原代海马神经细胞的方法尤为重要。本研究提供了一种分离培养海马神经细胞的方法，该方法可重复性好，获取的神经细胞生长及突触延展状态良好。

1材料与方法

1.1材料与仪器

小鼠脑切片模具、剃须刀片、眼用手术剪和镊子、离心管、细胞培养皿、1mL和5mL无菌注射器、台式离心机、显微镜、体视显微镜、超纯水机、高压灭菌锅、pH计、细胞培养箱

1.2试剂

Neurobasal medium（NBM）、B27 supplement（50祝MEM/F12、FBS、PBS、100姿埂？.22 m过滤器购自Thermo Fisher Scientific;Papain、Trypsin inhibitor、poly-D-lysine（PDL）、2-Amino-5-phosphonopentanoic acid（APV）、BSA、L-Cysteine、D-glucose、Sucrose、Hepes购自Sigma公司; NaOH、NaCI、KCI、Na2HPO4、KH2PO4购自国药化学试剂公司。

1.3实验动物

SPF级的C57BL/6J雌雄鼠购自南京大学模式动物中心，饲养于苏州大学实验动物中心SPF屏障系统。动物实验操作严格遵守苏州大学实验动物伦理委员会的要求。

2方法

2.1溶液配制

2.1.1 PDL配制及培养皿包被

灭菌的ddH2O溶解适量PDL，配制成0.1mg/mL的工作浓度。取1mL加入到35mm的细胞培养皿中，培养皿放置到细胞培养箱中孵育过夜。第二天吸弃未聚合的PDL，用PBS洗2次，即可接种细胞。

2.1.2解剖液

分别称取8g的NaCI，0.4g的KCI，0.024g 的Na2HPO4，0.03g的KH2PO4，2.35g的Hepes，6g的D-glucose和15g的Sucrose，加入700mL的ddH2O溶解后，使用1mol/L的NaOH调节溶液pH为7.4，然后定容至1L，高压灭菌后备用。

2.1.3 Papain酶消化液

分别取出50units的Papain，100 L的3mg/mL的L-Cysteine，50 L的5mM的APV，7 L的0.1mol/L的NaOH加到15mL的离心管中，用解剖液补足至5mL，该管记为Tube1。

2.1.4 BSA/ Trypsin inhibitor缓冲液

分别称取1g的BSA，1g的Trypsin inhibitor，加入7mL的解剖液搅拌溶解后，用1mol/L的NaOH调节溶液pH为7.4，定容至10mL，0.22 m滤器除菌后备用。

2.1.5 高浓度Trypsin抑制液

吸取3mL的解剖液，0.3mL的BSA/ Trypsin inhibitor缓冲液，30 L的5mM的APV放置到15mL离心管内混合均匀，均分到2个离心管内，分别记为Tube2和Tube3。

2.1.6低浓度Trypsin抑制液

吸取9mL的解剖液，90 L的BSA/ Trypsin inhibitor缓冲液，90 L的5mM的APV放置到15mL离心管内混合均匀，均分到3个离心管内，分别记为Tube4、Tube5和Tube6。

2.1.7细胞接种培养基

10%FBS+1%双抗+89%DMEM/F12。

2.1.8海马神经细胞培养基

10mL的B27（50祝┘尤氲？00mL的NBM中，混合即成。

2.2原代海马神经细胞制备

（1）性成熟的C57BL/6J雌雄小鼠按照2：1比例合笼配种。

（2）实验当天，将解剖液、脑切片模具、Tube1-6置于冰上备用。

（3）取胎鼠或者出生1-3天的小鼠，用酒精棉球擦拭鼠体表面除菌。

（4）剪下小鼠头部，去除头部皮肤和脑部肌肉，暴露头骨。

（5）轻轻地剪开软头骨，去除脑膜和血管后用弯镊取出完整的脑组织放到含有预冷解剖液的脑切片模具上。以下操作均在冰浴条件下进行，动作要迅速。

（6）用剃须刀片沿着脑部冠状轴切片，切成多片1mm宽的脑片。然后用1mL注射器针头将脑片转移到含有解剖液的培养皿中。

（7）体视显微镜下边观察边用针头去除脑片的其他组织，仅留海马区。

（8）将海马区组织转移到35mm培养皿中，加入Tube1中的Papain酶消化液，置于培养箱内消化30min，每10min取出用移液枪轻轻吹匀。

（9）将组织块转移到10mL的解剖液中，静置1min。

（10）组织块吸出转移到Tube2中，静置2-3min。

（11）按照上步操作，將组织块依次转移到Tube3-6中，每个Tube中均静置2-3min。

（12）吸出组织团加入到含有3mL的细胞接种培养基的离心管中，轻轻吹打组织团，组织团变散直至消失。

（13）细胞接种到PDL包被的培养皿中，置于37℃，5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养过夜。

（14）细胞培养2d后，换液，培养基更换为海马神经细胞培养基。

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