宋燕飞 - 陈祥贵 - 向俊丞 -王 玮 阴鹏飞 - 杨 潇

(1. 西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610039；2. 宜宾西华大学研究院，四川 宜宾 644004；3. 西华大学食品非热加工重点实验室，四川 宜宾 644004；4. 西华大学食品非热加工工程技术研究中心，四川 宜宾 644004)

农药残留一直是各国食品安全体系建设重点关注的内容[1]。中国是一个农业大国，农药使用十分广泛且管理困难，迫切需要发展适合基层监测监管的农药残留快速检测手段[2-3]。因此，采取及时、有效、快速的检测方法对农产品质量安全进行监管显得尤为重要。

在现有的农药残留检测中，气相色谱法[4]、气相色谱质谱联用法[5-6]、高效液相色谱法[7-8]和液相色谱质谱联用法[9-10]作为传统的手段，可以有效检测出果蔬中的农药残留量，但检测成本高、耗时长、不利于快速检测。而酶抑制法作为一种体外检测农药残留量的新型方法，具有操作简便、快速、灵敏度高、无需昂贵的仪器等特点，特别适合基层现场检测，是目前农药残留快速检测常用的方法[11]。

酶抑制法中，检测用酶是影响酶抑制法灵敏性和准确性的关键因素。国内外报道[12-14]用于农药残留检测的酶传感器所用酶绝大多数为乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)，且主要来自电鳗、家蝇和牛红细胞，酶源非常单一。课题组[15]前期研究中通过同源建模和分子对接预测各种酯酶对不同农药的敏感性，该方法在预测丝氨酸水解酶对有机磷农药的敏感性方面表现出良好的性能，发现锦龟头部酯酶和树鼩肝部酯酶具有较高的应用前景。试验拟以锦龟头部酯酶和树鼩肝部酯酶为研究对象，确定酶促反应的最佳检测条件，测定两种酶对常见有机磷类农药和氨基甲酸酯类农药的IC50和LOD值，为科学评价以锦龟酯酶、树鼩酯酶为酶源在酶抑制法中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

锦龟头部、树鼩肝部粗酶：保存于-20 ℃，中国科学院昆明动物研究所；

敌敌畏、敌百虫、氧化乐果、速灭磷、甲胺磷、对硫磷、乐果、磷铵、久效磷、毒死蜱、辛硫磷、克百威、速灭威、甲萘威、灭多威、涕灭威、丁硫克百威：国家农药质检中心；

碘化硫代乙酰胆碱(ATChI)、5,5’-二硫代-2,2’-二硝基苯甲酸(DTNB)、吲哚乙酸酯(3-Acetoxyindole)：分析纯，美国Fluka公司；

其他试剂：分析纯，美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

多功能酶标仪：SpectraMax i3x型，美国Molecular Devices公司；

电子天平：TB-214型，北京赛多利斯仪器有限公司；

超低温冰箱：Ultra Freeze3410型，丹麦Heto公司。

1.3 锦龟乙酰胆碱酯酶与树鼩酯酶的相对酶活测定

1.3.1 锦龟乙酰胆碱酯酶 根据Ellman法[16]测定并稍作修改。依次取50 μL磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.5)、50 μL 锦龟酶液、100 μL ATChI (1.5 mmol/L)加入96孔板，35 ℃下处理15 min，加入100 μL DTNB(1.5 mmol/L)显色，通过在412 nm处连续测量5 min内OD值的变化来检测相对酶活。同时以酶抑制法常用酶源电鳗乙酰胆碱酯酶在最适条件下的相对酶活作为对照酶活[17]。按式(1)计算锦龟酯酶相对酶活。

(1)

式中：

c——相对酶活，%；

m1——锦龟OD值变化；

m2——电鳗OD值变化。

1.3.2 树鼩酯酶 根据酶片法[18]测定并稍作修改。分别取100 μL磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH 8.0)、50 μL树鼩肝脏酶液加入96孔板，25 ℃下孵育15 min，加入50 μL 吲哚乙酸酯(8 mmol/L)，通过5 min内连续测量610 nm处荧光强度的变化来检测相对酶活。同时以酶抑制法常用酶源猪肝酯酶在最适条件下的相对酶活作为对照酶活[17]。按式(2)计算树鼩酯酶的相对酶活。

(2)

式中：

c——相对酶活，%；

m1——树鼩酯酶的荧光值变化；

m2——猪肝酯酶的荧光值变化。

1.4 酯酶抑制率的检测

在酶促反应体系中，分别加入不同浓度的酶抑制剂，同时以未加抑制剂组为对照组。分别按1.3的方法测定相对酶活，并按式(3)计算抑制率。

(3)

式中：

c——抑制剂，%；

m1——无抑制时反应体系OD值；

m2——有抑制时反应体系OD值。

1.5 锦龟酯酶与树鼩酯酶酶促反应条件的优化

1.5.1 pH、温度和反应时间对酶促反应的影响 在温度35 ℃，反应时间15 min下，考察pH(6.5，7.0，7.5，8.0，8.5)对相对酶活的影响；在pH 7.5，反应时间15 min下，考察温度(20，25，30，35，40 ℃)对相对酶活的影响；在温度35 ℃，pH 7.5下，考察反应时间(5，10，15，20，25 min)对相对酶活的影响。

1.5.2 正交试验 在单因素试验的基础上，选取最适pH值、温度、时间设计三因素三水平正交试验，优化酶促反应条件。

1.6 农药敏感性(IC50)研究

按1.4方法测量锦龟酯酶和树鼩酯酶抑制率，根据不同农药浓度(2×10-3，2×10-4，2×10-5，2×10-6，2×10-7，2×10-8mol/L)的酶抑制率C，以抑制剂浓度负对数(-lgC)为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制折线图，通过抑制率曲线方程，当y=0.5时，抑制率为50%，计算得到IC50。

1.7 数据处理

采用Origin 8、SPSS 16.0和Excel等分析软件对试验数据进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 pH、温度、反应时间对酶活力的影响

由图1可知，锦龟酯酶最佳反应条件为pH 7.5、温度35 ℃、反应时间15 min；树鼩酯酶最佳反应条件为pH 8.0、温度25 ℃、反应时间15 min。

2.2 最优反应条件确定

2.2.1 锦龟酯酶 根据单因素试验结果选择适宜参数水平，建立三因素三水平正交试验因素水平表见表1，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

图1 反应条件对酶活的影响

由表2、3可知，各因素对锦龟酯酶酶活影响次序为pH >温度>反应时间，且三者对酶活的影响均极显著，其中pH对酶活测定影响最大；最佳反应条件为A2B2C2，即pH 7.5、温度35 ℃、反应时间15 min。验证实验(n=9)测得，该条件下相对酶活为(108.440±0.176)%。

表1 锦龟酯酶酶促反应条件正交试验因素设计水平表

表2 锦龟酯酶酶促反应条件正交试验及结果

表3 方差分析表†

2.2.2 树鼩酯酶 根据单因素试验结果选择适宜参数水平，建立三因素三水平正交试验因素水平表，见表4，正交试验结果见表5，方差分析见表6。

由表4、5可知，各因素对树鼩酯酶影响大小为温度>pH>反应时间，pH、温度对树鼩酯酶影响差异极显著；树鼩酯酶最佳反应条件为A2B2C2，即pH 8.0、温度25 ℃、时间15 min。验证实验(n=9)测得,该条件下相对酶活为(113.569±0.351)%。

表4 树鼩酯酶酶促反应条件正交试验因素设计水平表

表5 树鼩酯酶酶促反应条件正交试验及结果

表6树鼩酯酶酶促反应条件方差分析表†

Table 6 Variance analysis of enzymatic reaction conditions of esterase from Tupaiabelangeri

2.3 特异性抑制分析

由图2(a)可知，当盐酸多奈哌齐、毒扁豆碱浓度分别为10-3，10-4mol/L 时，锦龟提取酶抑制率基本达到100%；当浓度分别为10-5，10-6mol/L 时，抑制率下降，但抑制率>70%；当双(4-硝基苯基)磷酸酯浓度为10-3mol/L 时，抑制率为56.32%，但在10-4，10-5，10-6mol/L 时，抑制率均<20%；锦龟提取酶对3种酶抑制剂的敏感性顺序为盐酸多奈哌齐>毒扁豆碱>双(4-硝基苯基)磷酸酯，表明锦龟头部提取的粗酶中可能主要为AChE酶。

由图2(b)可知，当抑制剂浓度为10-3，10-4mol/L 时，双(4-硝基苯基)磷酸酯、毒扁豆碱对树鼩提取酶抑制率均≥94%，当抑制浓度为10-5，10-6mol/L时，抑制率下降，但抑制率>70%；树鼩酶对3种酶抑制剂的敏感性顺序为双(4-硝基苯基)磷酸酯>毒扁豆碱>盐酸多奈哌齐，表明树鼩肝部提取的粗酶中可能主要为酯酶。

2.4 对不同浓度有机磷类、氨基甲酸酯类农药的敏感性

由图3可知，随着农药浓度的降低，5种有机磷农药对锦龟酯酶、树鼩酯酶的抑制率逐渐降低。当农药终浓度由10-4mol/L下降到10-9mol/L时，锦龟酯酶抑制率下降最明显的是速灭磷和辛硫磷，下降了68%；树鼩酯酶抑制率中，敌敌畏、敌百虫、速灭磷、磷胺、辛硫磷分别下降了52%，61%，57%，59%，74%。

图3 有机磷农药对酶的抑制效果

由图4可知，5种氨基甲酸酯类农药对锦龟酯酶、树鼩酯酶抑制率都较高。当农药终浓度由10-4mol/L 下降到10-9mol/L时，5种氨基甲酸酯类农药对锦龟酯酶抑制率随农药浓度降低逐渐降低，下降率最高的为克百威，下降了74%；而树鼩酯酶中下降率最高的为速灭威，下降了73%。

图4 氨基甲酸酯类农药对酶的抑制效果

表7 酶对有机磷类和氨基甲酸酯类农药的IC50

3 结论

试验表明，锦龟酯酶酶活的最佳反应条件为孵育温度35 ℃、孵育时间15 min、缓冲液pH 7.5；树鼩酯酶酶活的最佳反应条件为孵育温度25 ℃、孵育时间15 min、缓冲液pH 8.0。抑制剂敏感性试验表明锦龟粗酯酶中主要为乙酰胆碱酯酶，而树鼩肝部提取的粗酶中主要酯酶为酯酶。而锦龟酯酶和树鼩酯酶对常见有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感性均较高，且用于酶抑制法的LOD值均小于GB 2763—2019所要求的农药最大残留量限量。目前乙酰胆碱酯酶主要从家蝇、电鳗中提取，来源较少，难以满足检测过程中的需求，试验所选用两种酶源，对多数有机磷农药和氨基甲酸酯类农药敏感性较好，可作为酶抑制法快速检测农药残留的候选酶源。试验中仅将粗酶作为试验用酶，为进一步揭示锦龟酯酶和树鼩酯酶对农药的敏感性，下一步可先将锦龟酯酶和树鼩酯酶纯化，再分析其对农药的敏感性。