刘超，王鑫，景赞，吕雪梅，黄志勇，冯慧

(1.乐山市食品药品检验检测中心，四川 乐山 614000；2.黑龙江东方学院 学务处，哈尔滨 150066)

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

秋葵籽粕：市售，存于冰箱里冷冻；麸皮：四川嘉粮企业(集团)乐山面粉厂；面粉：市售；As3.042、UE336、UE336-2、As3.811：上海酿造研究所；米曲霉秋田种曲：株式会社秋田今野商店；甲醛(分析纯)，磷酸二氢钠(分析纯)、磷酸氢二钠(分析纯)：成都科龙化工试剂厂；干酪素：北京奥博星生物科技有限责任公司。

1.2 主要设备

TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 宁波天恒仪器厂；MJP-150型霉菌培养箱 上海森信实验仪器有限公司；FA124型电子天平 上海市舜宇恒平科学仪器有限公司；DUG-9076A电热鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司。

1.3 测定方法

中性蛋白酶酶活力的测定：采用蛋白酶活力测定法；水分的测定：采用食品中水分的测定方法[9]。

1.4 酪氨酸标准曲线的绘制

按蛋白酶活力测定法中1.3.1.2的要求，配制不同浓度的酪蛋白浓度。以净OD值为横坐标，酪氨酸质量为纵坐标，绘制标准曲线。不同浓度的酪氨酸溶液见表1。

1.5 菌种的筛选

本试验以中性蛋白酶活力为评价指标，于5个350 mL组培瓶中加入粉碎的烘至水分含量为10%左右的秋葵籽粕30 g，添加乳糖量为8%，加蒸馏水至曲水分含量为45%左右(±3%)，pH 6～7(自然)，灭菌后分别接入米曲霉As3.042、宁佐美曲霉、UE336-2米曲霉、米曲霉As3.811、米曲霉秋田种曲各6%，4层纱布润湿覆盖，霉菌培养箱中30 ℃培养60 h后测定中性蛋白酶活力。最终筛选出米曲霉As3.042为最优菌种。

1.6 制曲条件的优化

制曲是我国酿造工业的一项传统技术，是酱油酿造的重要环节。制曲时，从米曲霉菌体中分泌出的酶，不但使原料发生了变化，也是以后发酵期间发生变化的根源。所以，制曲的好坏直接影响酱品质和原料利用率。

“问渠哪得清如许？为有源头活水来。”华北分公司总经理吕新华对研究部署工作高度重视。井位部署是上游企业一切工作的开始， 井位部署质量的高低承载着众人的期望和关注。研究院承担着井位部署和其他科研工作，重要性不喻而言。

1.6.1 碳源种类对制曲的影响

于5个350 mL组培瓶中加入粉碎的烘至水分含量为10%左右的秋葵籽粕30 g，分别添加6%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糊精。加蒸馏水至曲水分含量为45%左右(±3%)，pH 6～7(自然)，灭菌后接入米曲霉As3.042种曲6%，4层纱布润湿覆盖，霉菌培养箱中30 ℃培养60 h后测定中性蛋白酶活力，确定最佳的碳源种类。

1.6.2 碳源添加量对制曲的影响

于6个350 mL组培瓶中加入粉碎的烘至水分含量为10%左右的秋葵籽粕30 g，分别加入碳源由(1.6.1确定)0、1%、3%、5%、7%、9%。加蒸馏水至曲水分含量为45%左右(±3%)，pH 6～7(自然)，灭菌后接入米曲霉As3.042种曲6%，4层纱布润湿覆盖，霉菌培养箱中30 ℃培养60 h后测定中性蛋白酶活力，得到最优的碳源添加量。

1.6.3 菌种接种量对制曲的影响

于6个350 mL组培瓶中加入粉碎的烘至且水分含量为10%左右的秋葵籽粕30 g，加碳源(由1.6.1、1.6.2确定)及蒸馏水至曲水分含量为45%左右(±3%)。分别按1%、3%、5%、7%、9%、11%的接种量接入米曲霉As3.042种曲，4层纱布润湿覆盖，霉菌培养箱中30 ℃培养60 h，培养结束后测定中性蛋白酶活力，得到最优的菌种接种量。

1.6.4 曲水分含量对制曲的影响

于6个350 mL组培瓶中加入粉碎的烘至水分含量为10%左右的秋葵籽粕30 g，加碳源(由1.6.1、1.6.2确定)，曲水分含量分别控制在35%、45%、55%、65%、75%、85%，pH 6～7(自然)。灭菌后按1.6.3确定的米曲霉As3.042接种量，4层纱布润湿覆盖，霉菌培养箱中30 ℃培养60 h后测定中性蛋白酶活力，得到最佳的曲含水量。

1.6.5 培养温度对制曲的影响

于4个350 mL组培瓶中加入粉碎的烘至水分含量为10%左右的秋葵籽粕30 g，加碳源(由1.6.1、1.6.2确定)及蒸馏水至1.6.4确定的曲水分含量，pH 6～7(自然)。灭菌后接入1.6.3确定的米曲霉As3.042接种量，4层纱布润湿覆盖，于24，27，30，33 ℃温度下分别培养60 h后测定中性蛋白酶活力，得到最优的培养温度。

1.6.6 制曲时间对制曲的影响

于7个350 mL组培瓶中加入粉碎的烘至水分含量为10%左右的秋葵籽粕30 g，加碳源(由1.6.1、1.6.2确定)及蒸馏水至1.6.4确定的曲含水量，按1.6.5确定的温度于霉菌培养箱中进行培养，pH 6～7(自然)。灭菌后接入1.6.3确定的米曲霉As3.042量，4层纱布润湿覆盖，培养时间分别为24，36，48，60，72，84，96 h。结束后分别测定中性蛋白酶活力，得到最佳的培养时间。

2 试验结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线的制备

以净OD值为横坐标，酪氨酸质量为纵坐标，得到酪氨酸标准曲线，见图1。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 碳源种类对制曲的影响

由图2可知，添加不同碳源对种曲的中性蛋白酶活力有不同的影响。以乳糖作为碳源，中性蛋白酶活最高，葡萄糖、蔗糖次之，麦芽糖、可溶性淀粉最差。这可能是米曲霉As3.042对乳糖的利用率最高，即本试验选取的最佳碳源为乳糖。

图2 不同碳源对制曲的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on koji making

2.2.2 乳糖添加量对制曲的影响

图3 乳糖添加量对制曲的影响Fig.3 Effect of the additive amount of lactose on koji making

由图3可知，乳糖添加量为7%时，中性蛋白酶活力达到最高。当乳糖添加量在0～7%范围内，中性蛋白酶活力随着乳糖添加量的增加而增大，这说明在一定范围内，碳源越多，米曲霉As3.042产中性蛋白酶越多；当乳糖含量过高时，中性蛋白酶活力下降，这可能是碳源过高对米曲霉的生长起抑制作用，所以本试验选择乳糖添加量为7%。

2.2.3 接种量对制曲的影响

图4 接种量对制曲的影响Fig.4 Effect of inoculation amount on koji making

由图4可知，在一定的范围内，中性蛋白酶活力随着接种量的增加而升高。当接菌量过低时，无法在短时间内扩大培养，导致产中性蛋白酶相对较少，酶活较低。当接种量为7%时，中性蛋白酶活力达到较大值；当接种量为11%时，中性蛋白酶活力反而下降，这可能是因为接菌量为11%时由于营养物质供给不足，米曲霉As3.042产生大量的休眠孢子，不能产生有效的中性蛋白酶。所以，本试验确定接种量为7%。

2.2.4 曲水分含量对制曲的影响

图5 曲水分含量对制曲的影响Fig.5 Effect of the moisture content of koji on koji making

由图5可知，当曲水分含量为60%时，中性蛋白酶活力达到最大值，说明曲水分含量为60%时米曲霉As3.042达到最佳的生长及产中性蛋白酶的状况，即本试验选择60%的曲水分含量。

2.2.5 培养温度对制曲的影响

图6 不同制曲温度对制曲的影响Fig.6 Effect of different koji-making temperatureson koji making

由图6可知，在一定的温度范围内，中性蛋白酶活力随着制曲温度的升高而升高，在30 ℃时中性蛋白酶活力达到最高。此时品温达到33 ℃，米曲霉分泌蛋白酶最旺盛。当温度在33 ℃时，此时品温达到36 ℃，此温度不适合米曲霉的繁殖生长，即本试验选择最佳的制曲温度为30 ℃。

2.2.6 制曲时间对制曲的影响

由图7可知，在24～96 h范围内，中性蛋白酶活力随着制曲时间的增加而升高，在制曲时间在36～48 h过程中，中性蛋白酶活力出现了质的飞跃，可能是在此阶段米曲霉As3.042孢子逐渐成熟，蛋白酶的分泌最为旺盛。在制曲时间为60 h时，中性蛋白酶活力达到较高值。考虑到生产效率，本试验制曲时间选择60 h。

图7 不同制曲时间对制曲的影响Fig.7 Effect of different koji making time on koji making

3 结论

本试验以秋葵籽粕为原料，以米曲霉As3.042为菌种，米曲霉As3.042产中性蛋白酶活力受碳源种类、碳源添加量、接种量、培养温度、培养时间、曲水分含量等影响。本试验制曲最适条件为乳糖添加量6%、接种量8%、培养温度31 ℃、曲水分含量60%、制曲时间60 h，此条件下成曲中性蛋白酶活力为6729.8 U/g。