张韫 高苏亚 唐一梅 高慧 邓佩颖

摘      要：以黄酮清除率为指标，以抗坏血酸为对照，运用紫外-可见分光光度法和荧光光谱法测定了黄酮对自由基的清除能力，评价盘龙七中黄酮的抗氧化活性。紫外-可见分光光度法测定黄酮对羟自由基的最大清除率达97.5%;对超氧阴离子的最大清除率达98.0%，对亚硝酸盐的最大清除率为60.0%;荧光光谱法测定黄酮对羟自由基的最大清除率为83.9%，对超氧阴离子的最大清除率为87.0%，且盘龙七中黄酮的抗氧化活性均优于抗坏血酸。盘龙七中黄酮对三种自由基的清除能力顺序为超氧阴离子>羟自由基>亚硝酸盐。对盘龙七中总黄酮的抗氧化活性进行了评价，可为盘龙七药材的抗氧化性能的深入开发和利用提供理论依据和实验参考。

关  键  词：盘龙七;黄酮;抗氧化;自由基

中图分类号：TQ031.7        文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2019）08-1651-05

Abstract： Taking the clearance rate of flavone as an indicator， using vitamin C as control， the scavenging ability of flavone to free radicals was studied to evaluate antioxidant activity of flavone by ultraviolet- visible spectrophotometry  and fluorescence spectrophotometry. The optimum ultrasonic extracting conditions for flavone was discussed and its antioxidant activity was evaluated. The results showed that the maximum clearance rates of hydroxyl free radical， superoxide anion and nitrite determined by ultraviolet-visible spectrophotometry were 97.5% ，98.0% and 60%; The maximum clearance rate of hydroxyl free radical and superoxide anion determined by fluorescence method was 83.9% and 87%. The order of clearance rate was superoxide anion > hydroxyl free radical > nitrite. The antioxidant activity of flavone from Rhizome Bergeni Scopulosae was evaluated， which could provide reference for the further exploitation， utilization and quality control of Rhizome Bergeni Scopulosae.

Key words： Rhizome Bergeni Scopulosae; Flavone; Antioxidant activity; Free radical

盤龙七为虎耳草科岩白菜属植物岩白菜的干燥根茎，多年生草本植物，多生长在阴湿的悬崖绝壁，分布于秦岭太白山、柞水、长安太平裕等地。盘龙七作为陕西地区的民间常用药，具有收涩固肠、补益脾胃、利水活血、活血化瘀、利水活血，祛风除湿、消肿止痛等功效[1]，其中主要含有岩白菜素、多元酚、黄酮、蒽醌、多糖等成分，其中黄酮是其重要的活性成分。黄酮类化合物具有抗抑郁、抗氧化、消炎镇静和提高免疫力等作用[2]。盘龙七黄酮具有清除自由基、抗衰老、抗肿瘤、增强免疫、抗疲劳、改善心血管等多种生理功能[3，4]。

自由基是生物体在代谢过程中不断产生的中间产物，如果体内的自由基聚集过多，就会损伤机体功能，加速衰老过程并可能引发各类疾病。目前文献中常用到的评价黄酮抗氧化活性的方法主要有羟自由基、超氧阴离子、亚硝酸盐清除法[5]。本实验以黄酮作为自由基清除剂，采用紫外光谱法和荧光光谱法对黄酮清除羟自由基、亚硝酸盐及超氧阴离子的能力进行测定，反映盘龙七黄酮的抗氧活性。抗坏血酸（VC）是一种良好的自由基清除剂，以VC的清除率作为实验对照，为实验提供了良好的参考依据。结果表明，盘龙七中黄酮的抗氧化活性均优于VC。

本实验的研究为黄酮提取的工业应用提供理论依据，为盘龙七药材的进一步开发利用和质量控制提供实验参考。

1  实验部分

1.1  实验仪器

FW200A高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）;智能型电热恒温鼓风机干燥箱（上海琅玕实验设备有限公司）;SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）;RE-2000A旋转蒸发器（巩义市予华仪器有限责任和公司）;KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;电热恒温水浴锅（河北黄骅市航天仪器厂）;UV-762型紫外可见分光光度计（上海佑科仪器有限公司）;荧光分光光度计（LS-55，PerkinElmer有限公司）。

1.2  实验试剂

盘龙七药材（不同产地）经西安医学院药学院生药教研室汪兴军老师鉴定为Bergenia scopulosa T. P. Wang的根茎。芦丁（批号20140919，纯度98%，上海士锋生物科技有限公司）;焦性没食子酸（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）;苯甲酸（分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司）;N-1-萘乙二胺盐酸盐（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）;无水对氨基苯磺酸（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司）;其余试剂均为分析纯。

2  实验方法

2.1  样品采集与处理

取盘龙七药材适量，洗去泥沙，粉碎过40目筛。精确称取100 g粉碎后的盘龙七粉末于圆底烧瓶中，加入1.5倍量的石油醚回流去脂质等干扰成分[6]，抽滤后于烘箱55 ℃烘干备用。

2.2  提取方法

精确称取5.0 g处理后的盘龙七粉末置于烧杯。以芦丁为对照品，通过绘制标准曲线测定黄酮含量。经单因素实验和正交试验设计[7]，以黄酮含量为指标，按照乙醇浓度60%，料液比为1∶25，提取时间60 min，提取3次的条件，超声提取总黄酮，结束后抽滤，收集滤液。滤液于旋转蒸发仪中浓缩，备用。

2.3  紫外-可见分光光度法的测定方法

2.3.1  盘龙七黄酮对羟自由基的清除能力

水杨酸（邻羟基苯甲酸）通过捕获·OH产生了有颜色的分子，该分子在510 nm的可见区有吸收峰。实验通过测定邻羟基苯甲酸捕获·OH所生成的产物分子，来计算黄酮对·OH的自由基清除率[8]。

将不同浓度的黄酮提取液分别加入10 mL容量瓶，再依次加入2.0 mmol/L硫酸亚铁2.0 mL和6.0 mmol/L水杨酸溶液2.0 mL，充分摇匀后加入1.0 mmol/L过氧化氢2.0 mL作为反应的启动剂，将容量瓶置于37 ℃条件下的水浴中加热0.5 h，以H2O为参比，采用紫外-可见分光光度法测定吸光度A。由于考黄酮提取液自身有紫外吸收，以试样空白为空白溶液，测出扣除空白的吸光度为A1，并测出空白对照液吸光度A0[9]，依据公式（1）算羟自由基的清除率。同法测定相同浓度下VC的清除率。

2.3.2  盘龙七黄酮对亚硝酸盐的清除能力

NO2-在酸性条件下与对氨基苯磺酸发生重氮反应后，再与N-1-苯基乙二胺盐酸盐偶合生成紫红色络合物在540 nm处有最大吸收，可用比色法测定NO2-的含量[10，11]。

在10 mL的容量瓶中加入不同浓度的黄酮提取液，加入5.0 μg/mL的NaNO2 2.0 mL，再将容量瓶放在37 ℃水浴锅中水浴加热反应0.5 h，各容量瓶依次加入2.0 mL的0.4%对氨基苯磺酸（Sulfanilic acid），充分摇匀并静置反应5 min;再精密吸取显色剂0.2%盐酸萘乙二胺1.0 mL加入容量瓶中，以H2O定容后反应15 min，以H2O为参比，测定各溶液的吸光度，考虑到提取液本身的吸光度，做试样空白，测出扣除试样空白的吸光度A1，同时测定空白对照液的吸光度A0，按公式（1）计算清除率。

2.3.3  盤龙七黄酮对超氧阴离子的清除能力

邻苯三酚在碱性条件下自氧化产生超氧阴离子，此物质在320 nm处有特征吸收，可用比色法测定超氧阴离子的含量[8]。

将不同浓度的黄酮提取液配制成不同浓度的溶液， 取4.5 mL的5.0×10-5 mol/L的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH=8.2），置于25 ℃水浴中预热20 min后，分别精密加入1.0 mL样品液和0.4 mL焦性没食子酸25 mmol/L溶液，充分摇匀后于25 ℃水浴锅中反应5 min，加入8 mmol/L 盐酸 1.0 mL作为反应终止剂，在320 nm波长下测定吸光度，记为A1，空白组以等体积H2O代替样品液，用紫外法测定吸光度记为A0 [10，12，13]。测得的数据代入公式（1）计算清除率。

2.4  荧光分光光度法的测定方法

2.4.1  盘龙七中黄酮对羟自由基的清除能力

Fenton反应产生羟自由基并发荧光，遇自由基清除剂后荧光减弱，通过荧光强度的变化，计算羟自由基的清除率。

在10 mL的具塞试管中，依次加入KH2PO4- Na2HPO4缓冲溶液（pH=5.47） 2.0 mL，1.0 mmol/L苯甲酸溶液2.0 mL，加入1.0 mmol/L硫酸亚铁溶液0.6 mL，0.3%的过氧化氢溶液1.2 mL，加H2O定容摇匀，反应2 h，用荧光分光光度计扫描确定最大激发波长及发射波长[14]。按上述方法加入试剂，以λex/λem=287/407 nm为测定波长，狭缝均为10 nm，扫速为300 nm/min，测定体系的荧光强度F，计算其与参比溶液（苯甲酸与缓冲溶液）荧光强度F0之差△F，并计算体系生成的·OH的含量[14]。在的Fenton体系中，先加入盘龙七的黄酮提取液再加入硫酸亚铁溶液。并测定Fenton体系的荧光强度Fs，则·OH清除率的计算见公式（2）：

2.4.2  盘龙七黄酮对超氧阴离子的清除能力

邻苯三酚在碱性条件下（pH=8.18缓冲溶液）自氧化生成超氧自由基，黄酮类物质可与Al（Ⅲ）形成络合物，以络合物在与O2-反应前后荧光强度的变化幅度作为检测其清除能力的指标[12]。

在具塞试管中加入一定浓度的黄酮提取液和0.8 mL Al（NO3）3摇匀，稀释至5 mL，5 min后以λex/λem=320/417 nm为测定波长，狭缝均为10 nm，扫速300 nm/min，测其荧光强度F0。在试管中加入Tris-HCl （pH=8.2）缓冲溶液2.0 mL，在25 ℃中加热10 min，再加入预热过的邻苯三酚0.1 mL，立即加入不同浓度的黄酮提取液，反应4 min后加入Al（Ⅲ）摇匀，稀释至5.0 mL，测其荧光强度F1，计算清除率见公式（3）：

3  结果与讨论

3.1  紫外-可见分光光度法的测定结果

由图1可以看出，随着黄酮浓度增大，对·OH清除作用依次增强[15]。当浓度为8.0 μg/mL时，清除率达到97.5%;相同浓度范围下，VC的清除率一直保持在4.0%左右，说明此浓度范围下，黄酮对羟基的清除能力优于VC。

由图2可以看出，盘龙七黄酮在0.54～5.43 μg/mL浓度范围内对亚硝酸盐的清除率呈不断增长的趋势，在5.43～13.03 μg/mL浓度范围内清除率在60.0%左右逐渐平稳并略有下降趋势;在相同的浓度范围内，VC的清除率虽有平稳但仍有上升的趋势。在此浓度范围内，黄酮对亚硝酸盐的清除率仍优于VC。

由图3可以看出盘龙七黄酮对超氧阴离子的清除率随浓度的增大而逐渐增大，浓度为13.03 μg/mL时清除率达到98.0%;VC在相同的浓度范围内清除率较小，并且不超过13.0%。结果表明，在此浓度范围内，黄酮对超氧阴离子的清除能力优于VC。

3.2  荧光分光光度法的测定结果

由图4可以看出，随着加入黄酮提取液的浓度增大，荧光强度逐渐减小;说明黄酮在此反应中属荧光猝灭剂。以黄酮浓度为横坐标，清除率为纵坐标作图。

盘龙七黄酮对羟自由基的清除率随浓度的增大而增大，在浓度为4 μg/mL时清除率稳定，达到83.9%。

由图5、6可以看出，加入邻苯三酚体系后最大波长发生变化;说明物质之间可能存在相互作用导致原物质的分子能级发生了改变。

4  结 论

盘龙七黄酮对羟自由基及超氧阴离子的清除率达98%，对亚硝酸盐的清除率达60%，且均优于VC，结果表明，盘龙七是一种良好的天然抗氧化剂，可作为具有抗氧化活性的天然药物，其抗氧化性应该是提取液中多种活性成分协同作用的结果。本实验为盘龙七的抗氧化活性成分的深入开发提供理论基础。

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