田明玉， 汤立军

(渤海大学 化学化工学院， 辽宁 锦州 121013)

0 引言

氟是人体必需的元素之一，氟离子(F-)在牙齿健康中起着重要的作用〔1-3〕.氟的缺乏容易患龋齿，但过量摄入F-会引发中毒并导致人体肾毒性改变和尿石症〔4-8〕.因此，对F-的识别与检测具有重要的意义.

迄今为止，已有多种用于F-检测的分析方法，包括光学分析，在线分析等.然而，这些技术通常需要昂贵的设备或专业操作人员.相比之下，荧光探针技术具有实施简单，灵敏度高，响应快速，非侵入性和实时检测等优点〔9-11〕，因而荧光探针在F-检测方面备受关注.目前已有大量识别F-的荧光探针被相继报道.然而，大部分已报道的F-探针的发射波长都比较短(<650 nm)，因而限制了它们在细胞成像方面的应用〔12-15〕.近红外(NIR，650-900 nm)荧光探针在近红外区域产生荧光，对活细胞的损伤小，具有更好的组织穿透能力，可有效减少生物系统中生物分子的背景荧光干扰，更适合用于生物体系的荧光成像.因此，设计合成结构简单、易于合成的近红外发射F-荧光探针仍有必要.

本文设计合成了一种基于异佛尔酮衍生物的新型近红外荧光探针L(反应式1).该探针利用叔丁基二甲基硅烷醚作为F-的识别基团，通过探针与F-的特异性反应，即F-触发探针中Si-O键的裂解〔9，16-18〕，释放出具有分子内电荷转移(ICT)性质的荧光团2，实现近红外发射的F-识别.此外，探针L可用于MCF-7细胞中F-的荧光成像.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

如无特殊说明，所用试剂和溶剂购自供应商并直接使用.化合物1和2按文献〔19〕方法制备.1H NMR和13C NMR 采用Agilent 400 MR核磁共振仪测试.高分辨率质谱(HRMS)用Bruker micrOTOF-Q质谱仪测试.荧光光谱用970-CRT荧光分光光度计(中国上海)测试.用PHS-25 B pH计(中国上海)进行pH测定.在Leica SP2(德国莱卡)激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞成像.

反应式1 荧光探针L的合成

1.2 合成探针L

将化合物2(174 mg，0.6 mmol)和三乙胺(162 mg，1.6 mmol)溶解在干燥的二氯甲烷(10 mL)中.将混合物在冰浴中冷却，逐滴加入叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl，227 mg，1.5 mmol)的干二氯甲烷(3 mL)溶液.室温搅拌反应2 h后，减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析分离(CH2Cl2洗脱)得到目标产物L(200 mg，收率82%).1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ7.64 (d,J=8.4 Hz,2H),7.28 (s,2H),6.91 (d,J=8.4 Hz,2H),6.87 (s,1H),2.60(d,J=29.6 Hz,4H),1.01 (d,J=24.8 Hz,15H),0.24 (s,6H);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ170.00,156.36,156.00,137.19,129.34,129.22,127.37,121.69,120.05,113.68,112.87,75.24,42.02,37.89,31.37,27.14,25.21.HRMS (ESI+):实测值C25H32N2OSi[M+H]+m/z404.2284, 计算值m/z403.2376.

1.3 光谱性能测试

阴离子储备液(10 mM，包括，F-,SO32-,SCN-,S2O32-,S2-, PO42-,P2O74-,N3-,HSO3-,HPO4-,HCO3-,CO32-,C2O42-,AcO-,I-,Br-,NO2-,Cl-,NO3-, ClO4-,H2PO4-,HSO4-和CN-，使用相应的钾盐或钠盐) 用去离子水配制.在DMSO中制备L(1.0 mM)的储备液，将该储备液用DMF/H2O(1/1，v/v，PBS 20 mM，pH=9.7)的混合溶液进一步稀释至最终浓度为10 μM.通过将相同剂量的阴离子加入到探针L中测定荧光光谱.对于滴定实验，将不同剂量的F-加入到探针L溶液中并荧光光谱变化.

1.4 细胞成像实验

用MCF-7细胞进行活细胞成像实验.首先将MCF-7细胞与探针L(10 μM)在37 ℃下孵育30分钟.用PBS缓冲液洗涤三次后，进行细胞成像.为了检测探针L在活细胞中传感F-的能力，将L预处理的活MCF-7细胞与不同浓度的NaF在37 ℃下原位孵育30分钟，然后将相同组的细胞用于荧光成像.

2 结果与讨论

2.1 探针L对F-的荧光响应

如图1A所示，探针L(10 μM)在DMF/H2O(1/1，v/v，PBS 20 mM，pH=9.7)溶液中显示出以675 nm为中心的弱发射带.向探针L中加入45倍(摩尔倍数，以下同)的F-时，可以观察到显著的荧光增强.然而，添加等倍数的其他阴离子，例如SO32-,SCN-,S2O32-,S2-,PO42-,P2O74-,N3-,HSO3-, HPO42-,HCO3-,C2O42-,AcO-,I-,Br-,NO2-,Cl-,H2PO4-,HSO4-和CN-，荧光强度无明显变化.这些结果表明探针L对F-具有高度选择性.此外，考察了探针L对F-的时间响应(图B)，发现荧光强度随时间延长而增强，并在40分钟内达到基本稳定，说明探针L对F-具有较快的时间响应.

图1 (A)探针L在DMF/H2O (1:1, v/v, PBS 20 mM, pH=9.7)溶液中对各种阴离子的荧光光谱响应

(B)在F-(450 μM) 存在下，探针L的荧光发射强度(675 nm)随时间的变化

进行了竞争实验，以研究在其他潜在干扰阴离子(SO32-,SCN-,S2O32-,S2-,PO42-,P2O74-,HSO3-,HPO4-,HCO3-,CO32-,C2O42-,AcO-,I-,Br-,N3-,H2PO4-, SO42-和CN-)存在下，探针L对F-的识别能力.如图2A所示，向探针L中分别加入45倍的各种阴离子，荧光强度无明显变化，继续向测试液中加入45倍的F-后，荧光强度均显著增强.这一结果表明，其他共存的阴离子对F-的识别过程没有明显干扰.由此可见，L对F-的识别具有良好的抗干扰能力.

为了进一步考察探针L的传感性质，进行了荧光滴定实验.如图2B所示，随着F-浓度的不断增大，探针L(10 μM)的荧光强度逐渐增强.当F-浓度为450 μM时，荧光光谱不再变化，此时已经达到了滴定饱和.可以观察到F-浓度在30-150 μM范围内与675 nm处的荧光强度之间具有良好线性相关性(R2=0.9904)(图3A)，表明探针L能够定量检测F-.基于滴定曲线的方法，计算出探针L对F-的检测限(LOD=3σ/k)为2.70×10-7M，说明探针L对F-的识别具有较高的灵敏度.

2.2 探针L对F-的识别机制

为了验证L对F-的识别机理，首先对L，L+F-和化合物2的薄层色谱(TLC)进行了对照，结果如图3B所示.可以看出，L+F-与化合物2具有相同的Rf值，由此推测F-造成了L中Si-O键裂解，释放出了化合物2.为了进一步证实该过程，将反应混合物中与化合物2具有相同Rf值的组分进行分离，并测试其1H NMR谱，所得氢谱与化合物2的氢谱进行比较(图4).在探针L的1H NMR光谱中(图4a)，0.24 ppm处的峰信号归属于苄基(CH2)，在探针L与F-反应的分离产物的1H NMR谱中消失，并且可以清楚地观察到归属于酚羟基的质子峰(9.98 ppm)(图4b).很明显，该分离产物与化合物2的氢谱几乎相同，证明L与F-反应生成了化合物2.L和F-的识别机制如反应式2所示.

图2 (A)在其他阴离子存在下探针L(10 μM)在DMF / H2O(1:1，v/v，PBS 20 mM，pH=9.7)溶液中对F-的荧光响应

(B)探针L的荧光光谱随F-浓度增大的变化

图3 (A)荧光强度(675 nm)与F-浓度(30-150 μM)之间的线性关系

(B)在手持紫外灯254 nm (左) 和365 nm (右) 照射下，探针L、L+F-的反应混合物和化合物2的TLC比较.TLC上的斑点为：a. 探针L, b. L+F-的反应混合物, c. 化合物2

2.3 探针L特异性识别F-的细胞成像

为了验证探针L在细胞成像中的潜在用途，研究了细胞中探针L对F-的荧光成像.在将探针应用于活细胞成像前，通过CCK-8方法测定了探针L对MCF-7细胞的毒性(图5).结果表明，即使在高达10 μM的探针浓度下，细胞存活率也大于90%，说明该探针对MCF-7细胞具有较低的毒性.因此，选择10 μM探针L进行细胞成像实验.用探针L孵育细胞30分钟，发现细胞几乎无荧光(图6B)，当用不同浓度的NaF(100, 200, 500 μM)进一步处理探针孵育过的细胞30分钟，观察到随着F-浓度增加，细胞荧光逐渐增强(图6C和D和E).这些结果表明L具有良好的细胞渗透性，并且能够对MCF-7细胞中的F-进行荧光成像.

图4 (a) 探针，L(b) 探针L与F-的分离产物，(c) 化合物2的部分1H NMR光谱比较

反应式2 探针L与F-的反应机制

图5 在不同浓度的探针L存在下培养的MCF-7细胞，通过CCK-8测定评估存活率(%)

3 结论

综上，本文设计并合成了一种结构简单的用于识别F-的荧光探针L，探针L在DMF/H2O(1/1，v/v，PBS 20 mM，pH=9.7)溶液中可高选择性、高灵敏度识别F-，且具有良好的抗其他阴离子干扰的能力，检测限为2.70×10-7M.探针L对F-识别的机理是通过F-造成探针中Si-O键的裂解，释放出相应的NIR发射荧光团.此外，探针L对MCF-7细胞具有很低毒性，并可用于MCF-7细胞中F-的荧光成像.