徐迪 徐冰彦 张浩 金日生

摘要：为研究油茶子饼粕多糖降血糖的活性，构建链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠，研究油茶子饼粕多糖对小鼠造模前后空腹血糖、各脏器指数以及肝脏、肾脏组织中丙二醛（MDA）含量及抗氧化酶活性的影响。结果表明，油茶子饼粕多糖显著影响造模前后小鼠的血糖值及各脏器指数，且MDA含量显著降低，抗氧化酶活性升高，说明油茶子饼粕多糖具有显著的降血糖活性。

关键词：油茶子饼粕多糖;降血糖活性;丙二醛;抗氧化酶活性

中图分类号：TS229;TQ281         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）20-0147-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.20.035           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on hypoglycemic activity of polysaccharide from camellia seed cake

XU Di1，XU Bing-yan2，ZHANG Hao2，JIN Ri-sheng2

（1.School of Biological Engineering，Wuhu Institute of Technology，Wuhu 241003，Anhui，China;

2.Engineering Research Center of Bioprocess Ministry of Education，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

Abstract： To study the hypoglycemic activity of camellia seed cake polysaccharide， the streptozotocin （STZ）-induced diabetic mice were constructed to study the effect of camellia seed polysaccharide on fasting blood glucose， several organ indexes and the content of malondialdehyde（MDA） and antioxidant enzyme activity in liver and kidney tissues of mice before and after modeling were studied. The results showed that the camellia seed cake polysaccharide significantly influenced the blood glucose level and organ indexes of mice， and the content of MDA was obviously decreased and the activity of antioxidant enzyme was increased， which indicated that camellia seed cake polysaccharide had significant hypoglycemic activity.

Key words： camellia seed cake polysaccharide; hypoglycemic activity; malondialdehyde; antioxidant enzyme activity

多糖（Polysaccharide）是一類由10个以上单糖分子通过糖苷键聚合而成的具有多种生物活性的生物大分子[1]。它具有抗氧化、提高机体免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多方面的生物活性[2-6]。多糖已逐渐展示出越来越广泛的应用前景，目前，已有近百种植物多糖被广泛应用到医药及食品中[7]。

油茶子饼粕（俗称茶枯）是油茶子机械榨油后的副产物，其中残留有茶多糖、茶油、茶皂素、淀粉、蛋白质及纤维素等多种有用物质[8]。但由于油茶子饼粕味苦、辛辣等原因，大多数的油茶子饼粕都被遗弃或者焚烧[9]，造成了极大的资源浪费。然而研究表明，油茶子饼粕中含有的茶多糖（含量为20%～40%[10]）具有降血糖[11]、降血脂[12]、抗氧化[13，14]、抗肿瘤[15，16]、抗菌[17]等多方面的生物活性作用。因此，开展油茶子饼粕多糖的研究对于油茶子资源的综合利用具有显著的意义。

以油茶子饼粕多糖为研究对象，研究油茶子饼粕多糖对链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病小鼠的降血糖活性，考察油茶子饼粕多糖对糖尿病的改善作用，旨在为开发油茶子饼粕多糖相关的药品及保健食品奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

三诺血糖仪（三诺生物传感股份有限公司）;Sartorious精密电子天平（北京赛多斯天平有限公司）;LG10-2.4A离心机（北京医用离心机厂）;数显恒温水浴锅（上海申胜生物技术有限公司）;ELGA超纯水机（英国Veolia Water Syestem公司）;752N紫外可见分光光度计（上海精科分析仪器有限公司）;imark酶标仪（美国Bio-Tek公司）。

油茶子饼粕多糖参考文献[18]的方法，自制;SPF级昆明小鼠，雄鼠，体重（20±2） g，购自安徽医科大学实验动物中心;普通饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司;链脲佐菌素（STZ）、胰岛素（INS）ELISA检测试剂盒购自Sigma公司;格列本脲片（2.5 mg/片）购自天津太平洋制药有限公司;丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒购自中国南京建成生物工程研究所;生理盐水购自山东康宁药业有限公司;柠檬酸和柠檬酸钠购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2  方法

1.2.1  高血糖小鼠模型的建立

1）试剂的配制。①柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的配制。精确称取2.1 g柠檬酸置于100 mL容量瓶中，加入去离子水定容，配制得溶液A;精确称取2.94 g柠檬酸钠置于100 mL容量瓶中，加入去离子水定容，配制得溶液B。②STZ溶液的配制。分别量取28 mL 溶液A、22 mL溶液B置于100 mL容量瓶中，加入去离子水定容，得溶液AB的混合液，即为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 4.5。称取一定量的STZ，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解STZ，使得溶液中STZ浓度为2%。STZ溶液不宜存放，现配现用。

2）造模方法。健康雄性昆明小鼠，预分组并标号，保持室温25 ℃，正常昼夜交替下普通饲料适应饲养一周，随机取15只小鼠，禁食12 h（自由饮水），测定空腹血糖值，作为小鼠的基础血糖值。取8只小鼠作空白对照组（NC），正常饲养。剩余小鼠禁食24 h（自由饮水），腹腔注射STZ（用前新鲜配制）造模，小鼠120 mg/kg BW.ip。5～7 d后小鼠禁食12 h（自由饮水），尾静脉取血，测定造模小鼠空腹血糖值，血糖值>16.8 mmol/L且出现明显“三多一少”症状（即多食、多饮、多尿及体重减轻）的小鼠即为高血糖模型成功的小鼠[19]。

1.2.2  成模小鼠的分组及给药  取造模成功的小鼠40只，随机分为5组，加上正常小鼠的空白对照组，总计6个组，进行每天灌胃试验，灌胃时间持续4周，保持正常昼夜交替，室内温度在25 ℃，室内通风良好，室内相对湿度维持在45%～65%，小鼠每日正常饮水摄食。

第一组（n=8）：正常对照组，正常小鼠，给予正常饮水摄食，灌胃等量生理盐水4周。

第二组（n=8）：糖尿病阳性对照组，血糖值>16.8 mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日给予正常摄食饮水，灌胃等量生理盐水4周。

第三组（n=8）：格列本脲阳性对照组，血糖值>16.8 mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日给予正常摄食饮水，灌胃10 mg/（kg·d）格列本脲片4周。

第四组（n=8）：多糖低剂量组，血糖值>16.8 mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日给予正常摄食饮水，灌胃50 mg/（kg·d）油茶子饼粕多糖4周。

第五组（n=8）：多糖中剂量组，血糖值>16.8 mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日给予正常摄食饮水，灌胃100 mg/（kg·d）油茶子饼粕多糖4周。

第六组（n=8）：多糖高剂量组，血糖值>16.8 mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日给予正常摄食饮水，灌胃200 mg/（kg·d）油茶子饼粕多糖4周。

1.2.3  小鼠各项指数的测定  试验过程中，密切观察小鼠的日常行为活动，每周测定并记录各组小鼠的体重，摄食量、饮水量及排尿量，空腹血糖值（测定前禁食12 h，不禁水），各脏器指数（小鼠各脏器的重量与小鼠体重的比值[20]）。

1.2.4  小鼠肝脏、肾脏组织中MDA含量及抗氧化酶活性的测定  取小鼠肝脏、肾脏组织块（0.2～1.0 g）用冰冷的生理盐水漂洗，滤纸拭干，称重，用量筒量取遇冷的生理盐水，用眼科小剪将组织尽量剪碎，倒入玻璃匀浆管中，充分研磨，使组织匀浆化，制成10%的组织匀浆，离心，取组织匀浆上层清液置于10 mL离心管中，于-60 ℃超低温冰箱冷冻保存备用。按照试剂盒说明书测定各组小鼠肝脏、肾脏组织中MDA、CAT、T-SOD、GSH-Px含量。

蛋白质分子基团中含有-NH3+，在蛋白质标准溶液中加入显色剂，-NH3+立刻与棕红色考马斯亮蓝染料中的阴离子结合，溶液呈蓝色，用紫外可见分光光度计在波长595 nm处测定其吸光值，由此可计算出小鼠组织中蛋白质含量。

1）小鼠肝脏、肾脏匀浆中MDA含量计算公式如下：

MDA含量（nmol/mg）=×标准品浓度（10 nmol/mL）÷待測样本蛋白浓度（mg/mL）

2）小鼠肝脏、肾脏匀浆中CAT活力的计算公式如下：

CAT活力（U/mg）=（对照管OD值-测定管OD值）×27÷反应时间（60 s）÷[待测蛋白含量（mg/mL）×取样量]

3）小鼠肝脏、肾脏匀浆中SOD活力计算公式如下：

SOD活力（U/mg）=÷50%×÷组织中蛋白含量（mg/mL）

4）小鼠肝脏、肾脏匀浆中GSH-Px酶活力计算公式如下：

组织GSH-Px酶活力=×标准品浓度（20 μmol/mL）×稀释倍数（5）÷反应时间÷（待测样本蛋白浓度×取样量）

5）小鼠肝脏、肾脏匀浆中蛋白质含量的计算公式如下：

蛋白浓度（nmol/mg）=×蛋白标准品浓度（0.563 mg/mL）×样本测定前稀释倍数

1.3  数据分析

均进行3组以上平行试验，所得数据经过统计学分析后用平均值±标准差表示，用Microsoft Excel和Origin 9.0对数据进行整理和绘图，用SPSS 18.0对组间差异进行分析。

2  结果与分析

2.1  小鼠一般状况的观察

从分组开始，对各分组小鼠的一般状况进行观察，记录见表1。正常对照组小鼠饮食饮水均正常，长势良好，毛发浓密而光滑，精神状态佳;造模成功的各组糖尿病小鼠具有明显的“三多一少”症状，多食多饮多尿，垫料潮湿，且小鼠精神状态不佳，随着天数的增加，高血糖模型空白对照组的小鼠“三多一少”症状越来越严重，日益消瘦，没有缓解;灌胃油茶子饼粕多糖低剂量组小鼠的症状与模型空白对照组小鼠症状相似，没有显著改善，而灌胃油茶子饼粕多糖的中剂量组和高剂量组小鼠较高血糖模型空白对照组和低剂量组小鼠精神状态逐渐好转，多食多饮多尿症状随着天数增加略有改善，到灌胃第3周，油茶子饼粕多糖高剂量组及格列本脲阳性对照组小鼠效果尤为显著，精神状态良好，多食多饮多尿症状明显好转，垫料较为干燥。由此可知，油茶子饼粕多糖具有降血糖的效果且与剂量有依赖关系，剂量组越高的油茶子饼粕多糖降血糖效果越好。

2.2  小鼠各项指数的测定

2.2.1  小鼠摄食量、饮水量及排尿量的测定  如图1、图2、图3所示，正常对照组小鼠摄食量、饮水量及排尿量均较少，维持稳定状态，随着小鼠体重增加仅有小幅度增长趋势，因此垫料干燥，无异味;而造模成功的高血糖组小鼠均出现明显的“三多一少”症状，各组高血糖小鼠的摄食量、饮水量及排尿量均有显著增加，高血糖模型空白对照组小鼠的摄食量、饮水量及排尿量一直处于较高水平，仅有小幅度缓解现象，可能是因为造模成功后在没有任何药物干预治疗的情况下，小鼠机体自身又具有一定的自愈功能，因此，症状有轻微缓解，小鼠的摄食量、饮水量及排尿量略有减少，但与阳性药物及多糖组小鼠干预治疗的效果相比小鼠的自愈功能较弱，自身恢复速度十分缓慢。试验进行到灌胃第2周及第4周结束，油茶子饼粕多糖的各剂量组高血糖小鼠的摄食量、饮水量及排尿量均有不同程度的减少，多糖低剂量组和中剂量组的高血糖小鼠的饮水量、排尿量有小幅度的减少，而多糖高剂量组对糖尿病小鼠摄食量、饮水量及排尿量的影响显著高于多糖低和中剂量组，小鼠的摄食量、饮水量及排尿量均显著下降。由图中数据可知，从某种程度上来说，给药多糖高剂量组4周后小鼠表观指标的恢复情况与阳性药物格列本脲相比所差无几，多糖高剂量组可以达到阳性药物格列本脲的降血糖效果。

2.2.2  小鼠体重测定  如图4所示，每周测定1次各组小鼠的体重，并对小鼠初始体重、成模后体重、灌胃处理2周及灌胃处理4周后的体重进行详细记录。由试验结果（图4）可知，给药前各组小鼠的体重均无明显差异，随着试验的进行，正常组小鼠体重呈均匀增长的趋势，而造模成功的糖尿病小鼠的体重与正常组小鼠体重相比，均有显著的减轻，明显低于正常小鼠的体重水平。试验给药2周及4周后，高血糖空白对照组小鼠的体重呈现逐渐下降的趋势，灌胃油茶子饼粕多糖中和高剂量组的小鼠及阳性对照组小鼠的体重维持造模后的体重水平或略有所增加，说明油茶子饼粕多糖制品能够有效缓解糖尿病引起的各种症状，对糖尿病引起的小鼠体重减轻现象有较为明显的抑制作用。

2.2.3  小鼠空腹血糖值的测定  如图5所示，每周测定1次小鼠的空腹血糖值（测定前禁食12 h，不禁水），并对小鼠的基础血糖值、成模后血糖值、灌胃处理2周及灌胃4周后的血糖值进行仔细记录。造模前，正常小鼠空腹血糖平均值维持在3～4，而造模后的高血糖组小鼠空腹血糖较正常组小鼠显著升高，平均值可达到20～24，说明糖尿病小鼠造模成功。给药2周及给药4周后，分别测定各组小鼠的空腹血糖值，高血糖组模型对照组小鼠血糖水平略呈上升趋势，灌胃油茶子多糖的低和中剂量组小鼠的血糖水平略有降低，但效果不明显，而灌胃油茶子多糖的高剂量组及格列本脲阳性对照组小鼠的空腹血糖水平都有显著降低。对比油茶子饼粕多糖低、中、高剂量组小鼠的空腹血糖值变化情况发现，油茶子饼粕多糖的降血糖效果与剂量有依赖关系，剂量组越高的油茶子饼粕多糖降血糖效果越好。

2.2.4  小鼠各脏器指数的测定  给药4周后，各种小鼠肝脏、肾脏及脾脏的器官指数如表2所示。高血糖模型空白对照组较正常对照组小鼠的肝脏、肾脏及脾脏的指数均有极显著上升，说明在STZ造模过程中对小鼠肝脏、肾脏及脾脏等各器官均造成了一定的损伤。给药4周后，格列本脲阳性对照组及多糖各剂量组小鼠的各器官指数均有不同程度的下降，且油茶子饼粕多糖高剂量组的小鼠各器官指数的下降趋势更明显，由此可知，油茶子饼粕多糖对恢复肝脏、肾脏及脾脏的脏器指数有显著功效，且恢复效果与剂量有依赖关系，剂量组越高的油茶子饼粕多糖恢复效果越好。

2.3  小鼠肝脏、肾脏中MDA含量和抗氧化酶测定

各组小鼠的肝脏、肾脏中MDA含量及抗氧化酶的活性测定如表3、表4所示，高血糖模型對照组小鼠肝脏及肾脏中的MDA含量均有明显的上升，这是由于链脲佐菌素成模的高血糖致使小鼠体内新陈代谢紊乱，体内氧自由基反应及其与体内新陈代谢系统处于的平衡关系被打破，产生自由基连锁反应而导致小鼠体内肝脏、肾脏的损伤，而多糖剂量组中小鼠肝脏、肾脏的MDA含量均有明显的降低，给药4周后，油茶子饼粕多糖各剂量组小鼠肝脏、肾脏中MDA含量及GSH-Px含量较高血糖模型对照组小鼠有显著降低，多糖高剂量组效果最为显著。

高血糖模型对照组小鼠肝脏的SOD和CAT活性显著降低，SOD和CAT在体内抗氧化过程中起着至关重要的作用，是机体不可缺少的抗氧化剂及抗氧化酶类。油茶子多糖灌胃4周后，小鼠肝脏中的SOD和CAT显著上升，且油茶子多糖剂量组越高的小鼠SOD和CAT上升越明显。本试验表明油茶子饼粕多糖不仅能降低血糖，还能增强高血糖小鼠肝脏及肾脏的抗氧化能力，增强小鼠体内清除自由基的能力，从而减轻自由基对小鼠胰岛β细胞的损伤，且恢复效果与剂量有依赖关系，剂量组越高的油茶子饼粕多糖降血糖效果越好。

3  小结

通过试验探究了油茶子饼粕多糖对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠降血糖活性的影响，结果表明，油茶子饼粕多糖均能有效缓解糖尿病小鼠的“三多一少”症状，多糖灌胃试验4周能显著降低糖尿病小鼠的血糖水平，且有效降低了高血糖小鼠肝脏、肾脏的MDA水平，同时提高了高血糖小鼠肝脏、肾脏的GSH-PX、CAT及SOD活性。且油茶子饼粕多糖的降血糖效果与剂量有依赖关系，剂量组越高的油茶子饼粕多糖降血糖效果越好。综上所述，油茶子饼粕多糖具有显著的降血糖活性，为油茶饼粕多糖相关功能产品的进一步深入研究及开发奠定了一定的理论基础。

参考文献：

[1] 刘迪迪，邱军强，程翠林，等.植物多糖降血糖作用研究进展[J].中国甜菜糖业，2017（1）：38-40.

[2] 李  平，王艳辉，马润宇.山茱萸多糖PFCAⅢ抗氧化性能研究[J].北京化工大学学报（自然科学版），2003，30（3）：35-38.

[3] KUANG H X，XIA Y G，YANG B Y，et al. Screening and comparison of the immunosuppressive activities of polysaccharides from the stems of Ephedra sinica Stapf[J].Carbohydrate polymers，2011，83（2）：787-795.

[4] KIM D H，YANG B K，JEONG S C，et al. Production of a hypoglycemic，extracellular polysaccharide from the submerged culture of the mushroom，Phellinus linteus[J].Biotechnology letters，2001，23（7）：513-517.

[5] 侯仰锋，汪东风，周小玲，等.茶多糖对高脂血症大鼠血脂及肝脏中微量元素的调节作用[J].营养学报，2008，30（3）：269-272.

[6] ZHOU X，XU G，SHEN B. Effect of freeze-dried sea cucumber powder of eastern sea on tumor and immune index of S180-bearing mouse[J].Journal of hygiene research，2008，37（1）：30-32.

[7] 杨  丹，任谓明，王艷红，等.复合多糖药理活性研究进展[J].上海中医药杂志，2016，50（3）：94-97.

[8] 卢基林.油茶饼粕的综合利用[J].化学工程师，1997（4）：11-12.

[9] 黎国庆，李盛宣，覃江克，等.油茶枯中皂素和多糖的综合提取工艺研究[J].中国油脂，2014，39（3）：70-73.

[10] 杨  强，胡海波，张石蕊.茶粕饲料资源开发及利用技术研究进展[J].饲料工业，2006，27（19）：53-55.

[11] 张宽朝，马皖燕，文  汉.油茶籽多糖降血糖作用的初步研究[J].食品工业科技，2014，35（2）：337-339，345.

[12] 陶  俊.油茶籽多糖分离纯化及降脂机理的研究[D].合肥：安徽农业大学，2010.

[13] SHEN S A，CHENG H R，LI X，et al. Effects of extraction methods on antioxidant activities of polysaccharides from camellia seed cake[J].European food research and technology，2014，238（6）：1015-1021.

[14] 胡平平.油茶饼粕多糖的提取、分离纯化及抗氧化活性研究[D].长沙：中南林业科技大学，2012.

[15] JIN X C，NING Y. Antioxidant and antitumor activities of the polysaccharide from seed cake of Camellia oleifera Abel[J].International journal of biological macromolecules，2012，51（4）：364-368.

[16] LI T T，ZHANG H，WU C E. Screening of antioxidant and antitumor activities of major ingredients from defatted Camellia oleifera seeds[J].Food science & biotechnology，2014，23（3）：873-880.

[17] HU J L，NIE S P，HUANG D F，et al. Antimicrobial activity of saponin-rich fraction from Camellia oleifera cake and its effect on cell viability of mouse macrophage RAW 264.7[J].Journal of the science of food and agriculture，2012，92（12）：2443-2449.

[18] 金日生，徐冰彦，袁传勋.响应面法优化酶法提取油茶籽饼粕多糖工艺[J].安徽农业科学，2016，44（11）：107-109.

[19] FERNANDEZ M L，UN E C K，TREJO A，et al. Biochemical and molecular roles of nutrients prickly pear（Opuntia sp.） pectin alters hepatic cholesterol metabolism without affecting cholesterol absorption in guinea pigs fed a hypercholesterolemic diet[J].Journal of nutrition，1994，124（6）：817-824.

[20] 何志仙，高云芳，胡琳琳.幼成年大白鼠和小白鼠比目鱼肌中Ⅰ和Ⅱ型肌纤维的比例与脏器指数的比较[J].动物学研究，2005， 26（3）：322-327.