熊琳姝

摘 要：通过基础培养基配置和孵化罩子自制并先后完成量雌雄果蝇交配，F1代果蝇培育与筛选，一日龄雄性果蝇精巢解剖，组织染色观察，RNA提取与反转录，DNA的提取，cDNA荧光定量等实验，由简入繁，顺利完成了为期两个月左右的实验，得出了相应的实验结果。

关键词：HmgD过量表达;果蝇;孵化率;电泳;荧光定量;吸光度

中图分类号：Q964 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2019）20-0208-02

通过对“HmgD基因过量表达调控”实验流程进行为期两个月学习与实际操作，顺利完成了相关实验并收获了很多新的实验技能操作方法与实验仪器使用方法。实验期间，主要使用了普通培养基和葡萄汁培养基的成分表与配置;果蝇胚胎孵化率统计的实验流程与相关操作技术;雄性一日龄果蝇精巢解剖实验操作技能;果蝇精巢RNA提取与cDNA合成;qRT-PCR（实时荧光定量PCR）原理及操作流程。同时，实验期间还使用了果蝇生化培养箱、超净工作台、解剖镜、电动匀浆器、低温离心机、PCR扩增仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、-80℃超低温冰箱等实验仪器，以及自制了果蝇孵化罩子。

具体来说，实验中实验材料是黑腹果蝇，其均是在温度25℃，湿度在45%～70℃条件下培养的，使用红糖-玉米培养基饲养而成的。我们分成两组，第一组负责USA-Rpt4R过量表达，第二组负责int6-RNAi基因敲降。所使用的果蝇品系一共有四种，分别是syncrip RNAi转基因品系、BamGal4vp16、ActGal/CyopscGFP和NosGal4/TM6B。笔者主要负责的的基因对是：Act/cyo♀×4T1♂。

实验结果及相关分析如下。

在该实验中，见表1，一共有五组孵化罩，每隔一天（24h）换一次培养基，并数出培养基上总卵数。第二天数饱满的未孵化卵数，而已孵化出幼虫的卵只剩下干瘪的卵壳，不进行计数。四组生物学重复实验的总平均孵化率约为60%，而对照组为67.7%>实验组平均孵化率，说明经过基因敲降处理的实验组雄性果蝇育性降低，说明α4T1这一基因与雄性育性相关联。

2 DNA电泳图

利用DNA在泳動时的分子筛效应和电荷效应，可达到分离混合物的目的。DNA在高于其等电点的溶液中带负电，向阳极移动，其迁移速率与其相对分子量成反比。通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA（RNA）带的亮度来分析EB作为一种荧光染料，能插DNA的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。条带越亮，DNA浓度越高。根据上图结果显示，除去marker以外的第二泳道条带亮度很高，说明此处加样的样品为目的DNA样品。

3 荧光定量结果

荧光定量结果的总体趋势走向正确，Act/cyo×4T1基因对为下调表达，而对照组是上调表达。但是数值反映出具有较大的误差，经过反思与分析，可能原因是因为荧光定量实验之前预习功课没有完全做好，实际上手操作时可能有的微小失误导致总体结果不尽人意。今后，进行实验操作前，要保证清楚每一步的过程与意义何在，要专心致志、细致完成每一步的操作，以保证实验结果真实可靠，成功完成实验。

4 RNA浓度及吸光度值

吸光度值之比一般在1.90～2.0区间内最好，吸光度值之比越大，说明提取的RNA纯度越高，反之则纯度越低。而浓度在600以上为较高浓度。实验数据反映，RNA提取总体比较成功，但也有部分基因对浓度较低纯度一般，说明在精巢解剖过程中可能带入了果蝇内脏碎片等杂质来源，也可能是组织破碎操作出现了问题，或者是由于装有RNA的EP管离开冰上时间长导致降解等因素影响，见表2。

参考文献

[1] 陈静，龚艳芬，胡争，王玉凤.高流动性蛋白基因过量表达对果蝇发育的影响[J].动物学报，2006，02：89-90.

[2] 赵超，李萍，谢冬生，胡纯华，熊焰，何丽英，李卫虹，肖春，杨普云，李正跃.斑翅果蝇田间发生与为害特性观察[J].应用昆虫学报，2017，05：56-59.

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[4] 陈静.过量表达HmgD对果蝇发育的影响[D].华中师范大学，2006.

On the Regulation of  Overexpression of  HmgD Gene

XIONG Lin-shu

（School of life sciences， central China Normal University，Wuhan Hubei  430079）

Abstract：Through the experiments of basic medium configuration and hatching cover self-made and successively completed the mating of male and female Drosophila flies， F1 generation Drosophila breeding and screening， one-day-old male Drosophila testis dissection， tissue staining observation， RNA extraction and reverse transcription， DNA extraction， quantitative fluorescence of DNA， etc.， from simple to complex， successfully completed the experiment for about two months， and obtained the corresponding experimental results.

Key words：overexpression of HmgD; Drosophila melanogaster; hatchability; electrophoresis; fluorescence quantification; absorbance