牛俊轲 卢宝慧 刘丽萍 李萌 王田 高洁

摘  要：為明确吉林省和黑龙江省烟草赤星病病原菌的种类，对吉林省15个烟区和黑龙江省7个烟区的烟草赤星病病原菌进行了分离鉴定，共分离获得312株致病菌株。通过形态学和分子生物学鉴定，共鉴定出4种链格孢属真菌，其中链格孢（Alternaria alternata）230株，细极链格孢（Alternaria tenuissima）78株，鸭梨链格孢（Alternaria yaliinficiens）2株，长柄链格孢（Alternaria longipes）2株。其中吉林省烟区鉴定出了链格孢、细极链格孢和鸭梨链格孢3种，黑龙江省烟区鉴定出了长柄链格孢、链格孢和细极链格孢3种。两个省区的优势种均为链格孢。此外，本试验利用5种基因序列片段（ITS、GDP、ACT、EF、RPB2）进行烟草赤星病菌的分子生物学鉴定，其中GDP基因仅能鉴定出链格孢和细极链格孢2种，RPB2基因能鉴定出4种链格孢，而ITS、EF、ACT基因序列比较保守，不适合区分这些链格孢种。本研究明确了吉林省和黑龙江省烟区引起烟草赤星病的病原菌种类，为下一步的定向防控奠定了基础。

关键词：烟草;赤星病;链格孢属;形态学;分子生物学

中图分类号：S435.72          文章编号：1007-5119（2019）05-0052-08      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.05.008

Abstract：In order to clarify the types of pathogens causing tobacco brown spot disease in Jilin and Heilongjiang Provinces， this study isolated and identified pathogens of tobacco brown spot disease from 15 major tobacco producing areas in Jilin Province and 7 major tobacco producing areas in Heilongjiang Province. A total of 312 pathogenic strains were isolated and identified. Four species ofAlternariawere identified through morphological and molecular biological identification， including 230 strains ofAlternaria alternata， 78 strains ofAlternaria tenuissima， 2 strains ofAlternaria yaliinficiens， and 2 strains ofAlternaria longipes.A. alternata，A. tenuissimaandA. yaliinficienswere identified in Jilin Province andA. longipes，A. alternataandA. tenuissimawere identified in Heilongjiang Province.A. alternateand A. tenuissimawere both identified in the two Province andA. alternatawas the dominant species in both Province. In addition， five gene sequence fragments （ITS， GDP， ACT， EF， RPB2） were used for molecular biological identification in this study， in which the GDP gene can only identifyA. alternataandA. tenuissima， RPB2 gene can identify all four species ofAlternaria， while ITS， EF， ACT gene sequences are more conservative. So ITS， EF and ACT gene sequences are not suitable for distinguishing the various species ofAlternaria. Through this study， the types of pathogens causing tobacco brown spot disease in Jilin Province and Heilongjiang Province were identified， which laid the foundation for the next stage of targeted prevention and control.

Keywords：tobacco; brown spot disease;Alternaria; morphology; molecular biology

烟草赤星病是由无性孢子类链格孢属真菌引起的烟叶成熟后期重要的叶部真菌性病害，有间歇性和爆发性发生的特点，病害严重时烟叶发病率可高达90%，使烤烟质量下降1～2个等级，重病区减產减值达50%以上，已成为生产优质烟的主要障碍^[3]。该病在世界各地烟区均有发生，且发生有明显的阶段性，苗期至旺长期很少发生，现蕾后赤星病开始出现，烟叶进入成熟阶段亦即进入了赤星病易感病阶段。烟叶成熟早、成熟度好，赤星病也相应发生的早而重^[1-2]。

目前，我国对烟草赤星病菌的鉴定是以形态学鉴定为主，分子生物学鉴定为辅的方式。如成巨龙等^[3]、祖燕青等^[4]和关博元等^[5]分别用形态学的方法对陕西、河南、重庆等地的烟草赤星病菌进行鉴定，没有用分子生物学进行验证，其中成巨龙等^[3]鉴定出陕西省的烟草赤星病菌有链格孢（A. alternata）和烟草链格孢（A. nicotianae）;祖燕青等^[4]鉴定出河南省的烟草赤星病菌有链格孢（A. alternata）、细极链格孢（A. tenuissima）、鸭梨链格孢（A. yaliinficiens）、长柄链格孢（A. longipes）和一个未知种;关博元等^[5]鉴定出重庆市的烟草赤星病菌只有链格孢（A. alternata）一种。胡中会等^[6]对云南省烟草赤星病菌进行rDNA-ITS序列分析，结果表明rDNA-ITS基因序列过于保守，不适合进行烟草赤星病菌种的鉴定。已有研究^[7-10]通过形态学或分子生物学两种方法分别对重庆、贵州、湖北、山东等地的烟草赤星病菌进行了鉴定，但所用ITS基因序列均不能很好地区分各个种，仅能进行链格孢属水平的鉴定。以上结果表明不同省（市、区）烟草赤星病菌种类不尽相同，但优势种主要为A. alternata，且鉴定结果都是形态学的鉴定结果，没有发现有效区分Alternaria多个种的基因序列。

目前，尚没有针对吉林省和黑龙江省烟草赤星病病原菌种类的系统研究。因此，故本试验采用形态学和多基因序列（ITS、GDP、ACT、EF、RPB2）两种方法进行鉴定，旨在探明吉林省和黑龙江省内各烟区烟草赤星病病原菌的种类及分布，以期为该病害的系统防治奠定基础。

1  材料与方法

1.1  烟草赤星病病样采集

2017年从吉林省15个烟区和黑龙江省7个烟区进行病害标本采集，并对采集到的病害标本进行拍照和编号，记录采集的时间、地点和发病特征。

1.2  试验培养基

PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1000 mL）;PCA培养基（马铃薯20 g，胡萝卜20 g，琼脂15 g，水1000 mL）;水琼脂培养基（琼脂15 g，水1000 mL）。其中葡萄糖、琼脂、分子生物学试剂药品以及引物合成均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3  病原菌的分离和保存

采用组织分离法进行烟草赤星病菌的分离，首先在病健交界处切下病组织，放入75%酒精消毒30 s，然后转入3% NaClO消毒2 min，用无菌水清洗3次，保证表面杂菌清洗干净，然后放在无菌操作台中吹干，再用无菌剪刀将组织剪成约0.5 cm²大小的小块，分别放在PDA培养基平板上，在25 ℃的恒温培养箱中进行培养。待病原菌产孢后采用单孢分离法进行烟草赤星病菌的纯化。取初分离的培养菌丝置于加入无菌水的离心管中振荡，分离菌丝上的孢子，取1 μL进行镜检，并调整其浓度。在PDA平板上加入20 μL已配制好的孢子悬浮液，涂板后于25 ℃恒温培养。当平板上形成单个菌落时，挑取菌落转接到新的PDA平板上培养以获得分离物的纯培养，纯化的菌种于4 ℃保存备用^[11-13]。

1.4  致病性测定

用盆栽的方法进行烟草品种云87的种植，常规管理至15片真叶展开后，选择中下部健康烟叶进行活体接种。将单孢分离菌株转至PDA培养基上，置于25 ℃恒温培养箱中培养。7 d后，在菌落边缘打取直径为8 mm的菌丝块，采用伤口接种法接种到健康烟叶上，并用脱脂棉进行保湿，无菌的琼脂块接种作为对照，每个菌株3个重复，每个重复接种3个叶片，5 d后观察发病情况。

1.5  烟草赤星病菌孢子形态和产孢表型观察

对分离得到的病原菌，观察其在PDA固体培养基和PCA固体培养基上的培养性状，包括菌落的形状、大小、颜色等，观察菌丝、分生孢子、产孢表型及分生孢子梗的形态特征，并测量大小，进

行显微拍照等。然后根据病组织的症状，结合病原菌形态特征进行病原菌鉴定^[14-16]。

1.6  烟草赤星病菌分子生物学鉴定

单孢菌株在PDA平板上培养5～7 d后，采用CTAB法提取致病菌基因组DNA，以基因组DNA为模板，用ITS4（5?-TCCTCCCGCTTATTGAT ATGC-3?）和ITS5（5?-GGAAGTAAAAGTCGTAAC AAGG-3?），GDP-1（5?-CAACGGCTTCGGTCG CATTG-3?）和GDP-2（5?-GCCAAGCAGTTGGTTG TGC-3?），ACT-512F（5?-TATCGTTCTCGACTCTGG TGAC-3?）和ACT-783R（5?-TCTGCATACGGTCG GAGATAC-3?），EF1-728F（5?-CATCGAGAAG TTCGAGAAGG-3?）和EF1-986R（5?-TACTTGAA GGAACCCTTACC-3?），RPB2-5F2（5?-GGGGWGA YCAGAAGAAGGC-3?）和RPB2-7CR（5?-CCCAT RGCTTGTYYRCCCAT-3?）5对引物进行PCR扩增，反应体系均为50 μL，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增好的产物由上海生物工程有限公司进行序列测定^[17]。将供试菌株测序结果序列在NCBI上采用BLAST比对分析，并在GenBank中下载相关标准菌株序列，使用Clustal X软件进行多重序列比对，然后将得到的比对结果使用在线软件Boxshade （http：//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）进行格式化，得到多重序列比对结果。将上述获得的多重序列比对结果导入MEGA 5.10 软件中，使用邻接法（neighbor-joining methods，NJ）构建系统进化树。

本试验在形态学鉴定过程中，认为在分生孢子和分生孢子梗形态相似的情况下，产孢表型的差别更加明显，在产孢表型的基础上结合分生孢子的形态、大小、横隔数、纵隔数等因素综合分析，从而完成形态学鉴定。在多基因分子鉴定中表明，ITS、EF、ACT基因序列保守，不适合进行链格孢种的鉴定，这与祖燕青等^[4]、胡中会等^[6]报道的结果一致，GPD基因序列相对保守，仅能区分A. alternata和A. tenuissima两种链格孢，但证明了RPB2基因在链格孢种间的序列差异明显，可进行Alternaria属下这4种链格孢种的区分，能作为烟草赤星病不同种的辅助鉴定。

本研究在烟草赤星病的病样采集中，吉林省采集的烟区涉及15个地点，基本覆盖了吉林省的所有烟草生产市县，黑龙江省共采集7个地点，虽然覆盖到了主要烟草产区，但由于黑龙江省烟草产区面积较大，故黑龙江省的烟草赤星病病样还应进一步采集鉴定。本试验分离得到的A. yaliinficiens和A. longipes菌株数量太少，可能与采样区域和数量有关，故应该在两省范围内继续采集烟草赤星病样，为烟草赤星病各个种病状的完善提供依据。

4  结  论

本研究通过形态学和多基因分子序列对吉林省和黑龙江省的烟草赤星病病原菌进行鉴定，明确了吉林省和黑龙江省烟草赤星病菌的优势种均为A. alternata，其次是A. tenuissima，另外在吉林省白城市洮北区和吉林省延吉市发现A. yaliinficiens，而A.longipes只是在黑龙江省肇州县永胜乡和黑龙江省哈尔滨市宁远镇有分布。证实了RPB2基因序列可以用来鉴定烟草赤星病病原。本试验为进一步研究烟草赤星病发生规律及致病机制奠定了基础，今后应进一步扩大取样范围，完善研究结果，为两省更有针对性地防治赤星病提供依据。

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