关 鹏，代小娟，秦培刚，宋金东，贺志有

(1. 渭南职业技术学院 农学院，陕西 渭南 714026；2. 新疆医科大学 基础医学部，新疆 乌鲁木齐 830011)

苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis, Bt)是在土壤、尘埃、植物表面、昆虫尸体以及污水等介质中广泛存在的一种革兰氏阳性细菌，由于其在芽胞形成过程中产生球形、立方体形、椭球形、菱形以及不规则形状等伴胞晶体[1-3]，又称杀虫晶体蛋白，对多种农林及卫生害虫具有特异性杀虫活性，而对人类及家畜无毒害，且不污染环境，因此成为全世界广泛应用的微生物杀虫剂之一。

随着Bt菌株及其杀虫功能基因在农林和卫生害虫生物防治领域的大量应用，害虫耐药性问题日益严重，生物防治效率显著降低，因此，害虫耐药性问题已成为Bt资源应用的一个瓶颈[4-5]。近些年来，广大科研工作者通过不断挖掘广谱高效杀虫活性的野生型Bt菌株[6]，克隆大量高毒力的Bt杀虫基因[7-8]，以及通过不同Bt杀虫基因进行片段置换或共表达等分子生物学手段解决害虫耐药性问题[9-10]，提高Bt生物防治的效果，因此Bt菌株资源和杀虫功能基因的研究成为Bt研究的热点之一。

Bt SG3-7菌株是一株从秦岭山区灌木丛土壤中分离的，能产生大量不规则伴胞晶体的野生菌株，本研究拟对该菌株的伴胞晶体形态、伴胞晶体编码基因的类型以及杀虫活性等方面进行分析，为该菌株在农业害虫生物防治中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 野生型Bt SG3-7菌株是从秦岭山区灌木丛土壤中分离得到并保存于本实验室。

1.1.2 测试昆虫 甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和棉铃虫(Helicoverpaarmigera)2龄期幼虫通过本实验室人工饲料进行饲养；菜青虫(Pierisrapae)2龄期幼虫通过新鲜甘蓝喂养。

1.1.3 培养基 1/2LB、LB固体和液体培养基配置方法参见文献[11]。

1.2 方法

1.2.1 Bt SG3-7菌株的活化及培养 吸取10 μL-20 °C保存的SG3-7菌株，接种在100 mL LB液体培养基中，30 °C，180 r·min-1振荡培养10～12 h，然后吸取2 mL培养液，按1:100比例转接入1/2 LB液体培养基中，在30 °C，180 r·min-1条件下振荡培养48～72 h，最后离心收集胞晶混合物。

1.2.2 Bt SG3-7菌株显微观察 取少量上述胞晶混合物先后用预冷的1 mol·L-1NaCl洗涤3次，预冷的无菌水洗涤2次，最后加入适量预冷的无菌水制成悬液。吸取2-3 μL悬液在载玻片上涂布均匀，经染色后进行光学显微镜观察，最后对悬液中胞晶混合物进行扫描电镜观察。

1.2.3 Bt SG3-7菌株中伴胞晶体蛋白的电泳分析 上述悬液经超声波破碎后，离心获得细胞裂解物，采用Sch?gger 等人方法对Bt SG3-7菌株中伴胞晶体蛋白进行SDS-PAGE电泳分析[12]。

1.2.4 Bt SG3-7菌株质粒DNA提取及杀虫基因型鉴定 参考关鹏等人方法对Bt SG3-7菌株中质粒DNA进行提取[11]。以该质粒DNA为PCR扩增模板，利用PCR-RFLP方法对该菌株中伴胞晶体蛋白编码基因的类型进行鉴定，引物序列参见文献[13-14]。扩增产物经与pMD19-T克隆载体连接后，转入大肠杆菌DH5α中，经蓝白斑筛选后，对阳性单克隆进行测序分析。运用NCBI数据库中 Blast工具对测序结果进行分析。

1.2.5 Bt SG3-7菌株的杀虫活性分析 将制备好的Bt SG3-7菌株胞晶混合物先用预冷的1 mol·L-1NaCl洗涤3次，再用预冷的无菌水洗涤一次，最后胞晶混合物经称重后，加入10 mL无菌水后震荡混匀，通过梯度稀释制成10～100 μg·mL-1等 6个不同浓度的测试样品组。对棉铃虫、甜菜夜蛾幼虫生物活性测定的方法参见文献[11]。对菜青虫幼虫的生物活性测定：选取新鲜的甘蓝制成大小相同的小块，然后分别均匀地浸泡在不同的测试样品中，然后取出，阴干，放入灭菌的培养皿中[15]。每个培养皿中放入2头幼虫，每个测试样品组做3个重复，以无菌水浸泡的甘蓝作为阴性对照。室温培养3～5 d，然后统计结果并用SPSS10.0软件分析计算LC50。

2 结果与分析

2.1 Bt SG3-7菌株的芽胞及伴胞晶体形态观察

通过显微观察发现，Bt SG3-7菌株在1/2 LB液体培养基中培养72 h后，有大量不规则形状的伴胞晶体及椭圆状芽胞产生，且芽胞与晶体呈分离状态。(图1-A，图1-B)。

图1 BtSG3-7菌株芽胞和伴胞晶体的显微观察

A：Bt SG3-7芽胞和伴胞晶体的光学显微镜观察；B：Bt SG3-7芽胞和伴胞晶体的扫描电镜观察；P：伴孢晶体；S：芽胞。

2.2 Bt SG3-7菌株的伴胞晶体蛋白的电泳分析

SDS-PAGE电泳分析表明，Bt SG3-7菌株主要表达130 kDa和60 kDa分子量大小的伴胞晶体蛋白(图2)。

图2 BtSG3-7菌株伴胞晶体蛋白的SDS-PAGE电泳分析

M：蛋白质分子量标准；1. Bt SG3-7菌株表达的伴胞晶体蛋白。

2.3 Bt SG3-7菌株的伴胞晶体蛋白编码基因的类型分析

采用PCR-RFLP方法对Bt SG3-7菌株的伴胞晶体蛋白编码基因的类型分析表明，该菌株质粒DNA中携带cry2Ab、cry4A、cry9Ea等3个cry基因片段，以及1个cyt1Aa型基因片段。

2.4 Bt SG3-7菌株的杀虫活性分析

Bt SG3-7菌株的胞晶混合物对鳞翅目的棉铃虫、甜菜夜蛾和菜青虫幼虫的杀虫活性分析表明，该菌株对甜菜夜蛾和菜青虫幼虫具有较高杀虫活性，其LC50分别为29.31 μg·mL-1和47.11 μg·mL-1，但对棉铃虫幼虫无杀虫活性(见表1)。

表1 BtSG3-7菌株胞晶混合物对三种鳞翅目害虫的杀虫活性测定

N：无杀虫活性。

3 讨论

经PCR-RFLP方法鉴定Bt SG3-7菌株内生质粒中携带有cry2Ab、cry4A、cry9Ea、 cyt1Aa型杀虫晶体蛋白基因。根据以前的研究报道，cry2Ab基因表达约70 kDa分子量大小的蛋白，对鳞翅目的小菜蛾(Plutellaxylostella)、棉红铃虫(Pectinophoragossypiella)等幼虫有显著杀虫活性[16-17]。cry9Ea型基因编码分子量约为130 kDa的蛋白，对粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、小菜蛾等鳞翅目幼虫具有特异性杀虫活性[18-19]。cry4A 和cyt1Aa型基因分别编码135 kDa和27 kDa的杀虫蛋白，两者均对双翅目的蚊虫具有特异性杀虫活性[20-21]。SDS-PAGE电泳分析表明，Bt SG3-7菌株主要表达130 kDa和60 kDa伴胞晶体蛋白，因此，可推测Bt SG3-7菌株的伴胞晶体可能由多个Cry蛋白混合形成，其次，cry2Ab和cyt1Aa型基因在该菌株中表达量极低，或者该菌株中携带的这两个基因可能不完整而未表达。另外，在Bt SG3-7菌株中鉴定得到的杀虫基因均不表达60 kDa伴胞晶体蛋白，因此这表明该菌株中可能含有其他新型杀虫基因未被鉴定。

鳞翅目的甜菜夜蛾和菜青虫对农业中多种蔬菜危害严重，而人们一直采用高毒性的化学农药对这些害虫进行防治，其结果造成环境污染，蔬菜农药残留，以及害虫耐药性的产生，这不仅威胁到人类的健康，而且大大增加的害虫防治的成本。本研究中Bt SG3-7菌株对甜菜夜蛾和菜青虫幼虫具有特异性杀虫活性，因此该菌株可作为备用Bt菌株资源，在农业生产上对甜菜夜蛾和菜青虫害虫特异性生物防治中应用。

在后续的研究中，将对Bt SG3-7菌株中这些杀虫基因进行克隆和表达研究，明确其杀虫活性。另外，采用其他方法对该菌株中其他新的杀虫基因进行鉴定和克隆，为该菌株在农业生产中的应用提供理论基础。