张晟铭，于庆生，彭 辉，刘举达，周富海，经文善，余树山，冯 辉

(1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学第一附属医院普外科，安徽 合肥 230031；3.安徽省中医药科学院中医外科研究所，安徽 合肥 230031)

肠道是机体进行食物消化与各类营养物质吸收的重要场所，同时也是机体各种细菌与毒素富集之地，人体内虽有各种屏障保护，但肠上皮黏膜机械屏障是机体抵抗肠道病原微生物入侵的首要屏障，因为其可有效通过其内紧密连接阻断大分子物质及各种微生物。研究发现，紧密连接主要由紧密连接蛋白(zonula occludin-1，ZO-1)、封闭蛋白、咬合蛋白构成[1-2]。

目前，通过多种方法干预肠黏膜上皮紧密连接及其分子结构的研究在国内外已有报道[3-4]，中医药对其影响的研究较少[5-6]，而有关健脾通里中药对手术创伤后肠黏膜上皮紧密连接及其分子干预的研究更是空白。既往研究证实，健脾通里中药芪黄煎剂在保护肠黏膜屏障功能上有显著疗效[7]，但其对紧密连接的作用尚未可知。

本研究拟观察芪黄煎剂对胃切除模型大鼠肠黏膜上皮紧密连接形态、宽度的影响，并观察其对小肠组织ZO-1、封闭蛋白、咬合蛋白mRNA表达的影响，以探讨其可能的作用机制。

1 材料

1.1 动物 45只健康清洁级Wistar雄性大鼠，日龄(56±7)d，体质量(298±22)g。由安徽医科大学动物实验中心[动物生产许可证号：SCXK(皖)2017-001]提供。在恒温(24±2)℃、光照12 h环境、相对湿度控制在45%～55%，自由饮水进食。

1.2 药物及配制 按照笔者既往研究方法[8]，将中药黄芪、大黄、白术、党参、枳实、厚朴、丹参、黄芩按20∶10∶20∶20∶10∶10∶15∶12质量比混合，量取按此比例混合的生药234 g，加水500 mL，煎30 min(其中大黄后下)，过滤浓缩至1.0 g/mL的生药煎剂，4 ℃保存。中药及整蛋白型肠内营养剂(德国milupa gub H生产，批准文号 H20030467)均购于安徽中医药大学第一附属医院药房。

1.3 试剂及仪器 Trizol试剂购自美国Thermo公司；逆转录试剂盒购自美国Thermo公司；LightCycler 480 SYBR Green I Master购自美国Roche公司，引物由上海生物工程股份有限公司合成；透射电镜(JEM-1010)购于日本日立公司；RT-PAR仪(StepOne型)购于美国Agilent公司；逆转录仪购于德国Eppendorf公司。

2 方法

2.1 动物分组及胃切除模型制作 实验前适应性喂养1周后，将大鼠按随机数字表法分为假手术组、标准肠内营养组、中药组，每组15只。采用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉所有大鼠，用75%乙醇无菌操作手术区，选择腹部中腹切口，逐层进入腹腔，找到大鼠的胃，切断胃的大小弯曲之间的胃前壁，用1-0丝线“8”字缝合。缝合后，在大鼠十二指肠悬韧带(Treitz韧带)远端15 cm的空肠前壁处，用12号注射器针头打孔，并将1.0 mm直径的硅导胶管置于空肠中。在腹壁上戳出另一个小孔，由导管的另一端将导管从颈背的双侧肩胛区域的皮肤取出，并且缝合腹部和颈部后切口。假手术组：随机选择15只清洁型大鼠，仅缝合中腹部切口，未进行胃切除术。

2.2 干预方法 ①假手术组：手术后仅自由饮水进食。②标准肠内营养组：术后第1天起，进行肠内营养，滴注方法、热量参照文献[8]方法，肠内营养制剂选用瑞素160 g用温开水溶解成500 mL的溶液，每100 mL含830 kJ热量，每只大鼠按每日120 kJ/kg提供热量，每日注入肠内营养液容积的计算公式：

V(营养液)=(120 kJ/kg×m(体质量)/(8.3 kJ/mL)。

式中体质量的计量单位为kg。每小时滴入营养液2 mL，分2次注入，持续1周。③中药组：滴注的营养制剂、热量、方法、疗程均同标准肠内营养组。按照文献[8]的方法，在滴注营养液前给予芪黄煎剂，每小时滴入营养液2 mL，每日2次，温度保持25 ℃。持续1周。

2.3 标本制作和指标检测方法

2.3.1 紧密连接结构检测 所有大鼠干预7 d后，1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后取材，2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定，90%乙醇混合90%丙酮(1∶1)脱水，纯丙酮+OTC包埋液(1∶2)室温过夜包埋，45 ℃烘箱内烘烤12 h固化，超薄切片机对组织块切片为50～60 nm，铀铅染液染色，透射电镜下观察肠黏膜上皮细胞紧密连接的超微结构并摄片保存，使用螺旋测微器测量照片中紧密连接宽度，对照放大倍数计算得出紧密连接宽度。

2.3.2 荧光定量PCR检测ZO-1 取100 mg小肠组织，液氮中研成粉末，收集入2 mL Eppendorf管中，加入1 mL Trizol，按照说明书操作提取总RNA，在One drop超微量分光光度计上检测260 nm和280 nm吸光度，分析RNA的纯度和含量。使用MMLV Reverse Transcriptase试剂盒(大连宝生物公司)将总RNA转录成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq Kit (Takara Bio Inc.)进行qPCR检测，PCR反应在ABI StepOne Plus系统上进行，95 ℃下预变性10 min；95 ℃下反应20 s，60 ℃下反应30 s，72 ℃下反应30 s，共40个循环。以GAPDH作为内参，2-ΔΔCT法计算mRNA的相对表达量。扩增使用的引物：

封闭蛋白：正向引物为5′-CCTGCCCCAATGGAAGATTT-3′，反向引物为5′-CCGATGACAGCCATCCACAT-3′；

咬合蛋白：正向引物为5′-TGCATGTTCGACCAATGC-3，反身引物为 5′-AAGCCACTTCCTCCATAAGG-3′；

ZO-1：正向引物为5′-CGCCTCTGTCCAACTCTTCTCT-3′，反向引物为5′-GTGTGAATCGGTTGTATGCTG-3′；

GAPDH：正向引物为5′- GGAAAGCTGTGGCGTGAT-3′，反向引物为5′- AAGGTGGAAGAATGGGAGTT-3′。

3 结果

3.1 3组大鼠肠黏膜上皮细胞紧密连接形态及宽度比较 透射电镜下，3组大鼠肠黏膜紧密连接结构(箭头所示)均清晰可见，紧密连接位于上皮细胞侧面、近游离面的顶端，呈狭窄的带状(焊接线或嵴线)；紧密连接处可见细胞膜表面不连续的融合点或吻合点。见图1。与假手术组比较，标准肠内营养组大鼠肠黏膜上皮细胞紧密连接宽度显著减小(P<0.05)；与标准肠内营养组比较，中药组大鼠肠黏膜上皮细胞紧密连接宽度显著增加(P<0.05)。见表1。

3.2 3组大鼠小肠组织中ZO-1、封闭蛋白、咬合蛋白mRNA表达水平比较 与假手术组比较，标准肠内营养组大鼠小肠组织中ZO-1、封闭蛋白、咬合蛋白mRNA表达水平均显著下调(P<0.05)；与标准肠内营养组比较，中药组ZO-1、封闭蛋白、咬合蛋白mRNA表达水平均显著上调(P<0.05)。见表2。

注:A.假手术组;B.标准肠内营养组;C.中药组图1 3组大鼠肠黏膜上皮细胞紧密连接的形态(铀铅染液染色,1×20 000倍)

表1 3组大鼠紧密连接宽度比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与标准肠内营养组比较，#P<0.05

表2 3组大鼠小肠组织紧密连接相关

注：与假手术组比较，*P<0.05；与标准肠内营养组比较，#P<0.05

4 讨论

肠上皮作为肠腔与肠间质之间的界面，不仅调控机体水液以及各组营养物质的运输，还为抵抗各类病原体及抗原提供了第一道屏障，这一作用的实现有赖于肠上皮细胞间的重要结构——紧密连接[9-10]。紧密连接结构主要由两种ZO-1组成，一种是细胞膜上存在的跨膜结构蛋白；另一种是位于细胞质中的蛋白质，其与细胞的各种蛋白质结合，并且具有膜蛋白和细胞骨架桥梁的作用。它们呈带状广泛分布于细胞中，前者主要由跨膜蛋白咬合蛋白与封闭蛋白构成，后者主要由胞内支架蛋白ZO蛋白家族组成[11]。它们连同细胞骨架一起，是紧密连接黏膜屏障功能的结构基础，决定了肠道的选择透过性[12]。

封闭蛋白是一种分子量约20 000的紧密连接跨膜蛋白，两个细胞外环和一个短细胞内环由211个氨基酸残基组成，相邻细胞通过外环由“拉链”结构封闭，封闭蛋白的C-末端能与ZO-1相互作用来促进紧密连接的合成，促进伤口愈合[13]。咬合蛋白是一种分子量约为65 000的跨膜蛋白，其结构与封闭蛋白类似，差异在于其N-末端与C-末端显著缩短。有研究结果表明，咬合蛋白可能参与协调细胞骨架的活动与各种信号通路，以维护上皮细胞表型，促进创伤的愈合[14-15]。ZO-1是一种分子量为2.2×105的支架蛋白，由1 475个氨基酸组成。研究发现，ZO-1可以感受到胞外对紧密连接的机械冲击，进而协调细胞增殖分化，极化细胞，装配连接细胞的过程，从而促进创伤的愈合[16]。本实验结果表明，胃切除大鼠肠黏膜紧密连接连续性和完整性遭到破坏，紧密连接宽度明显变窄；运用健脾通里中药芪黄煎剂后，大鼠肠黏膜上皮受损的紧密连接得到修复。从分子生物学角度来分析，本实验中胃切除大鼠模型的建立使ZO-1、封闭蛋白、咬合蛋白mRNA表达水平降低，提示创伤能够使肠黏膜受到损伤；运用芪黄煎剂后，肠上皮内ZO-1、封闭蛋白、咬合蛋白mRNA水平显著增加，说明中药芪黄煎剂能够修复受损的肠黏膜细胞。其作用机制可能是提升了肠黏膜上皮细胞ZO-1、封闭蛋白、咬合蛋白水平，加速肠黏膜中ZO-1的恢复，加速肠黏膜屏障的恢复，促进机体的恢复。

笔者根据长期的临床实践[17-19]观察到，胃癌术后患者早期常出现气短、乏力、舌淡、苔白、脉细弱，或是腹部胀痛、肛门未排气排便的症状，属于气血虚弱与腑实气滞并存的证候。依据李东垣《脾胃论》中补中益气汤和张仲景《伤寒论》中大承气汤的组方的启示，取补中益气汤中黄芪、白术和党参以补其虚，取大承气汤中大黄(后下)、枳实和厚朴以泄其实，再配伍黄芩、丹参并命名“芪黄煎剂”。方中大黄通里攻下、荡涤肠胃，枳实行气散结、消痞除满，厚朴行气消积、通腑行气，此三药配伍取大承气汤之功用以推陈出新，促进胃切除术后胃肠之腑蠕动、传化功能恢复。黄芪健脾补中、益气养血，能够加快全身各器官组织功能恢复及加快消化道功能恢复；白术补气健脾，促进胃肠运动，抑制胃酸分泌；党参补脾养胃，健运中气，促进小肠对营养物质的吸收。此三药配伍取补中益气汤之功用以补脾益气、行气养血，促进胃切除术后气血亏虚的恢复。再辅以黄芩清热解毒，丹参活血化瘀，能够改善微循环，增加吻合口周围血流量，和具有清热泻下的大黄配伍能消除吻合口炎症、水肿并促进其愈合。诸药配伍互相协调，以达到健脾通理的功效。研究发现，健脾和通里中药可以保护肠黏膜屏障[20-21]。既往的临床及实验研究证实芪黄煎剂具有类似的作用[7，17]。并且最近的动物实验阐明其机制为芪黄煎剂调节ZO-1、封闭蛋白、咬合蛋白的表达，抑制ZO-1的磷酸化水平，恢复肠黏膜屏障的紧密连接连续性和完整性，从而达到保护肠黏膜屏障的作用[8]。

本实验从肠黏膜细胞亚显微结构和分子水平研究健脾通里中药芪黄煎剂能否保护肠黏膜ZO-1结构及其可能的机制，为临床上应用芪黄煎剂奠定了理论基础。