陆祥家, 兰思仁, 蔡文杰, 刘仲健,6

(1.福建农林大学兰科植物保护与利用国家林业和草原局重点实验室，福建 福州 350002;2.福建农林大学园林学院，福建 福州350002;3.台湾成功大学兰科植物研究和发展中心，台湾 台南 701;4.台湾成功大学热带植物科学研究所，台湾 台南 701;5.台湾成功大学生命科学学院，台湾 台南 701;6.华南农业大学林学院，广东 广州 510640)

被子植物又名开花植物或有花植物，起源于早白垩纪或更早时期，在白垩纪末期(6 500年前)发生大量的辐射适应后，它们占据了几乎所有的生境[1].古植物学及分子系统发生学与分支学两大领域的研究彻底改变了植物学家对植物进化的理解[2].作为被子植物最大的科之一，兰科分为5个亚科，有超过28 000个种[3].兰科植物如何进化出如此丰富的多样性，必须结合最新的基因组数据、化石及分子生物学技术进行相关研究，以加深对兰科植物进化过程的了解，从而对被子植物进化有进一步的理解.因此，研究兰科植物的起源和进化是植物学研究中的重要课题.

兰科植物的多样性体现在花形态的起源与进化上，花部发育是受MADS-box基因家族的调控.古老起源的MADS-box基因编码了一个长度为55～60个氨基酸的高度保守的MADS(MCM1/AGAMOUS/DEFICIENS/SRF)结构域.MADS-box基因通过全基因组复制(whole gene duplication, WGD)在有花植物中扩增，并参与开花时间、花器官分化、果实发育和植株发育的调控[4-5].MADS-box基因家族的古老起源和进化，对植物的繁殖器官，特别是兰科植物花的形态建成尤为重要.因此，MADS-box基因家族成为兰科植物进化研究的重要对象.本文将重点介绍兰科植物基因组的研究进展，并揭示MADS-box基因家族在兰科植物花形态建成和进化中的作用.

1 现存兰科植物的起源

1.1 古生物学研究结果

第一个被发现的兰科植物化石的花粉块以附着在Proplebeiadominicana(一种灭绝的无刺蜂)胸背上的方式，被保存在多米尼加共和国的15～20百万年前的中新世琥珀中[6]；之后，另一个更古老的兰科植物化石被发现在中新世波罗的海的40～45百万年前的琥珀中[7].然而，分子系统进化树研究表明，现存兰科植物的最近共同祖先可能早在76～84百万年前的白垩纪晚期就已出现[5].而结合兰科生物地理学和系统发育推测，兰科植物最早出现在112百万年前的澳大利亚[8].总之，目前已知的兰科植物化石仍然稀少，且比理论上的兰科植物共同祖先更为年轻.因此，兰科植物的起源仍然是一个谜，而通过兰科植物基因组学的研究为探索其起源和进化提供新方法.

1.2 基因组学研究结果

作为植物学研究中的一种宝贵资源，基因组序列可以通过比较基因组学的研究探讨植物进化的问题，也为兰科植物的起源和进化提供了技术支撑和借鉴.在植物中，拟南芥(Arabidopsis)的全基因组在2000年首次通过Sanger法完成测序，该方法使用了细菌人工染色体(BAC)、噬菌体(P1)和具有转化能力的人工染色体(TAC)文库来进行测序[9].继拟南芥之后，又以此相同的方式对另外3种植物(水稻、高粱和玉米)的基因组进行了测序[10-12].随着计算机科学的发展，测序技术及用于组装大量测序数据算法的进步，次世代测序技术在测序植物基因组方面变得更受欢迎和更为经济实惠[13].近年来，第3代测序技术已经可得到平均长度为20 kb的长读长数据，为克服复杂和多倍体植物基因组组装提供了帮助[14-15].到目前为止，大约有200种植物已经进行了基因组测序与组装，其中包括模式和非模式植物[16].这些技术和成果促进了兰科植物基因组学的研究.兰科植物中3个物种(小兰屿蝴蝶兰Phalaenopsisequestris、铁皮石斛Dendrobiumcatenatum和深圳拟兰Apostasiashenzhenica)高质量的参考基因组已经完成了测序与组装[17-19].这些基因组数据结合兰科植物化石证据为推测兰科植物的起源和演化历史提供了新的方法.

1.3 兰科植物的起源

现存兰科植物的5个亚科分别为拟兰亚科(2属17种)、香荚兰亚科(15属180种)、杓兰亚科(5属130种)、树兰亚科(500多属24 000种)和兰亚科(208属3 630种)[3,19].不像其他兰科亚科的花那样具有两侧对称、唇瓣(修饰的花瓣)、蕊柱(雄蕊和雌蕊融合生成的合蕊柱)和花粉块(粘合成的花粉粒)，拟兰亚科的花具有辐射对称的花被，没有完全特化的唇瓣；具有3个雄蕊，部分与雌蕊合生形成相对简单的合蕊柱和粉状花粉[19-20].此外，系统发生学研究表明，拟兰亚科通常被认为是兰科的基部类群[21-22].因此，拟兰亚科被认为比其他现存的兰科亚科起源更古老.解决现存兰科植物起源之谜的可能方法之一就是能够将拟兰亚科与其他兰科亚科基因组之间进行对比研究.而覆盖所有兰科亚科的12种兰科植物的旁系同源基因中的每个同义位点(Ks)的同义取代分布显示了Ks为0.7～1.1，这反映了兰科植物存在一次WGD事件.兰科植物与芦笋Asparagusofficinalis(兰科植物近缘科的物种)之间的旁系同源物和直系同源Ks分布的比较结果表明，这次WGD事件仅存在于兰科植物的共同祖先中.结合共线性分析和同线性分析的结果表明，兰科植物这一特异性WGD事件发生在白垩纪/古近纪的分界线附近.现存兰科植物的共同祖先发生WGD后，随即在短期内通过基因的丢失或扩张，分化为5个亚科，其中，拟兰亚科丢失的基因最多.这些结果暗示着拟兰亚科可能不是兰科最古老的类群，也许只是拥有更为古老的性状而已.基于5个现存的兰科亚科从一个共同的祖先独立进化而来的观点，那么，若将WGD后设定为现存兰科植物基因组进化的一个基点，可以认为：(1)未发生WGD前的兰科植物祖先，其基因组大小只是发生WGD后兰科植物的一半.因此，未发生WGD前的兰科植物与现存的兰科植物在形态上将存在重大差异.(2)现存兰科植物的祖先在发生WGD后拥有最完整的遗传信息，随即开始基因的丢失或扩增，开启了现存兰科植物的进化起点.(3)现存的兰科植物主要在发生WGD后，不同的兰科植物通过特异的基因丢失和扩张进而分化为5个亚科.在5个亚科中，拟兰亚科丢失的基因最多，而树兰亚科丢失的最少.因此，树兰亚科的基因组最接近兰科植物的共同祖先在发生WGD后的基因组，并可能保留了比较多当时的特征.而拟兰亚科丢失的基因最多，其形态可能更接近发生WGD前的兰科植物祖先特征.

基于兰科植物WGD后的基因组信息，相对于兰科的分子系统进化树[23]，顶部的类群拥有基因组信息与发生WGD时最为相近，而基部的类群与发生WGD时差别最大，更接近WGD前的兰科植物.基因组分析结果显示，WGD后先形成兰科植物的两侧对称性(唇瓣的出现)，随后由于调控唇瓣发育基因的丢失导致唇瓣演化为“花瓣”，产生了辐射对称性的拟兰亚科的花.因此，WGD后兰科植物可能从两侧对称演变为辐射对称.两侧对称的兰科物种促进传粉专化性的形成以更加适应新生境，从而分化出更多的物种.受兰科植物进化路径的启发，被子植物的进化可能具有与兰科植物相似的模式：现在所有被子植物的科几乎同时都出现在白垩纪晚期，它们几乎都发生了与兰科植物相似的WGD[24].现存被子植物的前祖先发生了WGD，躲过了白垩纪晚期的大灭绝事件后，占据灭绝物种留下的生态位而产生大量的辐射适应.这为现存的被子植物突然在白垩纪晚期发生物种大量辐射适应，而之前很少出现的“达尔文进化之谜” 提供了一种解释.因此，在追踪被子植物的起源，追溯它们的前祖先时不应该只以现在的被子植物的形态作为参考标准，它们有可能具有截然不同的形态.

2 兰科植物形态的进化

正如前面所述，拟兰亚科与其他4个亚科在形态上有很大的差异，特别是在花的唇瓣、蕊柱和花粉形态上明显不同.通过对深圳拟兰与其他兰科植物以及被子植物基因组的比较，发现兰科植物有474个特有基因家族.因此，得以重建一个兰科植物祖先的基因工具包和基因池，并可从中窥视兰科植物新的基因家族及其扩张和收缩的进化历史，特别是调控兰科植物开花的MADS-box基因“生”与“死”的历史踪迹，从而揭示了唇瓣、合蕊柱、花粉块、无胚乳种子的发育及地生与附生习性进化的分子机制.

2.1 MADS-box基因家族和兰科植物花部形态的进化

图1 MADS-box基因家族在蝴蝶兰中的表达模式Fig.1 Expression pattern of MADS-box genes in Phalaenopsis perianth

兰科植物演化成一个很独特的类群[22]在于它的花部器官的构成：3枚萼片、3枚花瓣(其中一枚特化为唇瓣)和合蕊柱[19].MADS-boxⅡ类基因家族包括E类、C/D类、 B-AP3和AGL6基因家族，比其他物种有更多套基因.这些扩张的基因家族调控了兰科植物花部器官的发育[25-29](图1).

合蕊柱是兰科植物花部构成的一个标志性的器官，经分析和验证的结果显示，合蕊柱的发育由一个C类基因 PeMDAS1和一个D类基因PeMADS7所调控[30-31].蝴蝶兰基因组数据的应用，已鉴定MYB基因调控花的颜色的形成[31]以及TCP基因调控胚珠的发育[32].

唇瓣(修饰的花瓣)可以吸引传粉者并为其提供采蜜时的“着陆平台”[33-34]，然而，深圳拟兰具有一个未分化的唇瓣和辐射对称的花被(图2).MADS-box中的B-AP3和E类基因参与调控其唇瓣的形成[17,35-36].在深圳拟兰、小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛中分别有2、4、4个B-AP3基因和3、6、5个E类基因. B-AP3和E类基因的数量均在深圳拟兰中减少.B-AP3基因的进化树和共线性分析表明，B-AP3和E类基因在现存兰科植物的共同祖先中扩增，而深圳拟兰丢失了B-AP3和E类同源基因而不能形成特化的唇瓣，导致花被恢复到祖先状态(图3)[19].

a：拟兰属的花；b：蝴蝶兰属的花.图2 兰科植物的花部形态Fig.2 The morphology of orchid flowers

图3 参与兰科植物形态进化的MADS-box基因Fig.3 MADS-box genes involved in the morphological evolution of orchids

2.2 兰科植物的尘状种子和多样化

种子形成于植物的繁殖阶段，无论是裸子植物还是被子植物均是这样.一般来说，种子中发芽的营养物质通常储存在胚乳中.然而，兰科植物种子仅含有胚芽，没有胚乳和其他明显的组织分化.未能形成功能性的胚乳会导致在单个蒴果内含有大量微小种子(称为粉状种子)[37].MADS-boxⅠ类基因在种子发育中起关键作用，特别是在胚乳发育的早期阶段和指定雌配子体时期[38-40].MADS-boxⅠ类基因可分为3类：Mα、Mβ和Mγ. Mα和Mγ MADS-box基因在小兰屿蝴蝶兰、深圳拟兰和大叶仙茅Molineriacapitulata的种子发育过程中表达[19].然而，Mβ MADS-box基因不存在于兰科植物基因组中，包括小兰屿蝴蝶兰、深圳拟兰和铁皮石斛，但在拟南芥、毛果杨Populustrichocarpa、水稻Oryzasativa和大叶仙茅中发现[19].因此，丢失的Mβ MADS-box基因可能与兰科植物的种子没有胚乳相关[18]，从而形成微小的种子[33].兰科植物进化出没有胚乳的种子，而将能量用于更多种子的产生致使一个果实可达几万个种子，同时，变小的种子更容易传播以占领新生境形成新物种.

兰科植物种子缺乏营养来源(胚乳)，迫使兰科植物种子以独特的方式发芽.兰科植物种子发芽后在叶片发育成熟之前，劫持了共生菌根真菌并吸收共生真菌的营养物质[41].有趣的是，胚乳中后合子的杂交屏障是植物中主要的杂交障碍类别之一[42-43].即使是不发育胚乳的兰科植物种子，它也可能在兰科植物中引起低强度的种间杂交障碍[44].兰科植物，如小兰屿蝴蝶兰进化出自交不亲和的繁殖系统，是由于在其基因组的杂合区存在大量的杂合子所致[17].然而，缺乏较强的种间杂交障碍和杂合区在多种兰科植物中发现，如阴生红门兰[45]、红门兰[46]、眉兰[47-48]和树兰[49-50]，且在东南亚的兜兰种群中证实了网状进化[51].因此，推测种间杂交和属间杂交在兰科植物物种多样性的演变中起着重要作用.

2.3 花粉块的形成

花粉块是一种花粉粒粘合成块的组织，在兰科和萝藦科中独立进化，可以附着在授粉昆虫身上以便传播，在该种群的辐射分布方面发挥作用[52-53].在维管束植物中，MIKC*MADS-box基因(包括P-和S-亚类基因)在花粉成熟过程中的雄配子体发育中的功能是相当保守的[53-54].除了具有散生花粉粒的深圳拟兰，P-亚类基因已经在兰科植物中丢失[19].相比于其他4个亚科具有庞大的物种(从180种到超过24 000种)，现存拟兰亚科仅有少量物种(17种).因此，其他亚科的兰科植物MIKC*MADS-box基因中P-亚类成员的丢失被认为导致花粉块的进化(图2)[55].花粉块的形成，是兰科进化史上的一项关键创新，在促进兰科植物新物种的形成上起重大作用.这是由于花粉块形成后产生了花朵间一对一的传粉模式，促成了生殖隔离从而有助于新物种的形成.不像拟兰亚科那样，一朵花的花粉可以散播给许多朵花而造成后代同质化.

2.4 兰科植物附生习性和景天酸代谢的进化

许多兰科植物具有附生习性，它们不在地面上生长，而是附生于其他植物(通常是树木)、岩石和任意固态物上.附生性兰科植物可更接近阳光和/或进入几乎没有竞争的领地[16-17].附生性兰科植物的根部有一些特殊的适应性构造，包括海绵表皮和根膜，以帮助它们紧贴树木，从雨水和空气中收集水分和养分[20,56-57].拟南芥中的AGL12基因调控根分生组织的细胞增殖而分化出地生根，而丝叶狸藻Utriculariagibba由于缺乏AGL12相似基因，没有形成真正意义上的根[58-59].附生种类的兰科植物也没有AGL12相似基因，但地生的深圳拟兰含有一个在根部高度表达的类似AGL12基因.此外，与根相关的MADS-box基因亚家族ANR1在附生兰(小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛)中也减少[19].功能性四聚体复合物的形成是花器官特定MADS-box蛋白的显著特征[59].两种花被特定基因(B-AB3和E类)及两种与根发育相关的MADS-box基因(AGL12和ANR1)分别在深圳拟兰和小兰屿蝴蝶兰中一起丢失(图3).因此，推测AGL12和ANR1基因可能参与类似于B-AP3和E类的功能性复合物的合成.当这些基因丢失时，参与复合物形成的其他基因则不能发挥更多功能，致使兰科植物生长出气生根，从而进化出兰科植物的附生特征.另一方面，调控景天酸代谢的基因(α碳酸酐酶)明显扩张致使兰科植物进化出景天酸代谢功能[17,29,60-62]，促进了附生习性的产生.铁皮石斛大量抗性基因(R-基因)的扩张和多糖合成通路的进化使它能适应不同的生态条件而有较为广阔的分布区[18].这种附生特性的形成，可使兰科植物利用其他植物所不能利用的生境进行生长.这些生境之间存在很大差异，容易隔断兰科植物物种的基因交流(即生境隔离)，有助于促进新物种的产生.

3 结论和展望

比较基因组学是研究物种进化的一种非常有用的技术方法.通过比较拟兰亚科和树兰亚科完整的高质量参考基因组，揭示现有的兰科植物是从一个共同祖先进化而来的，它在白垩纪后期发生WGD后开启了现存兰科植物的起源，随后在较短的时间内通过基因的丢失和扩张分化出5个亚科.兰科植物独特形态的进化是由相关基因参与调控所致.因此，在此基础上开展对尚未有全基因组数据的香荚兰亚科、杓兰亚科和兰亚科的3个亚科物种参考基因组的测序，将有助于全面了解兰科植物的进化及形态多样化形成的分子机制.