习硕，赵蕾，史爱华，章振华，李林，沈佳，崔丽娜，姜北宇，张建伟

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京 100097)

禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)是严重危害家禽和野禽的一种烈性传染性病原，根据其临床致病性差异，将其分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)[1]。其中，H9N2亚型低致病性禽流感病毒(LPAIV)感染禽类虽然引起的死亡率较低、临床症状较轻，但仍然是威胁我国养禽业的重要病原之一[2]。H9 AIV不仅广泛存在于活禽市场，还可以感染人[3-4]。有报道表明，目前流行的H9 AIV可以作为基因供体，为多种流感病毒提供内部基因与其他亚型病毒重排，给新型流感病毒在人群中的大规模流行埋下了隐患[5]。通过疫苗免疫接种预防禽流感仍然是现今采用的主要手段。值得注意的是，近年来H9 AIV的变异现象时有发生，其中2011-2014年H9 VIA的变异速度是1999-2005年的10.64倍[6]。然而，AIV抗原大多利用非免疫鸡胚制备，病毒在鸡胚中的传代是造成AIV基因变异的主要原因之一[7-8]；其次，禽流感流行需要大量疫苗时，有可能存在鸡胚供应不足的问题；同时，制苗用鸡胚的来源不明，也有造成外源病毒污染的可能[9]。与传统鸡胚制苗方法比较，动物悬浮细胞制备疫苗具有细胞来源和背景清晰，不含有外源病毒的优点，病毒抗原稳定，批间差异小，易于扩大和大规模生产等优点。许多学者比较了MDCK贴壁细胞制备的人流感疫苗与鸡胚源疫苗的效果，认为两种疫苗有着相当的免疫效果[10-12]。为了探讨和验证由北京市农林科学院畜牧兽医研究所纯悬浮驯化的MDCK细胞制备H9亚型AIV抗原疫苗免疫效力，进行了MDCK细胞源疫苗和鸡胚源H9亚型AIV疫苗的比较试验，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 MDCK悬浮细胞株(MDCK-sus)由北京市农林科学院畜牧兽医研究所免疫与预防研究室购自中国兽医药品监察所的MDCK贴壁细胞自行驯化获得，悬浮细胞批号为20190520，代次为MDCK-sus F10。

1.1.2 病毒株 制苗毒株：H9亚型AIV BX13株由北京市农林科学院畜牧兽医研究所免疫预防研究室2013年从北京某鸡场分离、纯化及鉴定，毒株代号为A/Chicken/Beijing/BX/13(H9N2)株(BX13)。制苗毒株为H9亚型AIV BX13株1-E3，批号：20170523，毒价为107.7EID50/0.1mL。攻毒毒株为H9亚型AIV BX13株1-E1，批号：20170411，毒价为108.7EID50/0.1mL。

1.1.3 鸡胚 SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，在本研究室孵化至10日龄，用于毒种繁殖，毒价测定及攻毒后的分毒试验。

1.1.4 试验动物 21日龄SPF鸡购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，北京市农林科学院畜牧兽医研究所SPF鸡舍饲养。

1.1.5 HI抗原 HI工作抗原由本研究室制备，H9亚型AIV BX13株1-E3，批号：20170425，HA效价为29，使用时按照1∶128配制4HA工作抗原。

1.1.6 鸡红细胞悬液 1%鸡红血球由本研究室采集成年公鸡血液制备，用于收获的病毒液HA和试验鸡的血清HI抗体测定。

1.1.7 主要试剂与耗材 无血清培养基MS01购自苏州市沃美生物技术有限公司；250 mL三角瓶购自Corning公司。

1.1.8 仪器设备 细胞摇床购自上海一恒科技有限公司；倒置显微镜购自上海光学仪器厂；血球计数板购自上海市求精生化试剂仪器有限公司；2L生物反应器BioFlo©/CelliGen©115购自美国NBS公司。

1.2 方法

1.2.1 疫苗制备 分别制备鸡胚源和MDCK纯悬浮细胞源疫苗。鸡胚源疫苗抗原制备方法为取10万倍稀释的AIV BX13制苗毒株，接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1 mL, 密封针孔，置37 ℃孵育，每24 h照蛋，弃去24 h内死亡鸡胚，收获24 h～120 h内死胚和120 h时活胚的鸡胚尿囊液，测定其HA和EID50，用作制备鸡胚源疫苗抗原。

MDCK细胞源疫苗抗原制备方法为将2L生物反应器进行清洗、安装、高压灭菌后冷却备用，取生长到一定密度的细胞，使用无血清MS01培养基制备成密度为2.0×106/mL ～2.5×106/mL的细胞悬液1L，以感染复数(MOI)0.01接种H9亚型禽流感病毒BX13株，同时按照3.5 μg/mL的终浓度加入TPCK-Trypsin，将以上细胞-病毒混合液加入到生物反应器中，设置生物反应器参数，溶氧DO为40%，pH 7.2，温度33 ℃，搅拌速度60 r/min, 收获培养72 h的抗原液，测定其HA和EID50，用作制备细胞源疫苗抗原。

疫苗制备方法为首先分别将2种抗原液加入终浓度为2 mL/L的甲醛溶液，置37 ℃恒温摇床内灭活24 h。经灭活检验合格后取上述2种灭活抗原液，分别制备鸡胚源抗原水相和细胞源抗原水相，同时制备油相，以油相∶水相比为2∶1的比例乳化制成油包水型灭活疫苗，配苗时收获抗原液的病毒滴度均为107.7EID50/0.1mL。

1.2.2 疫苗物理性状检验 外观：应为白色均匀乳剂。剂型：取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。稳定性：吸取疫苗10 mL加入离心管中，以3500 r/min离心15 min, 管底析出水相应不超过0.5 mL。粘度：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。无菌检验：按现行《中国兽药典》进行，应无菌生长。

1.2.3 免疫试验分组与免疫接种 90只21日龄SPF鸡随机分为9组，A1～A4组每组10只鸡，分别胸肌注射鸡胚源灭活疫苗，注射剂量为0.3、0.2、0.1、0.02 mL/只(107.7EID50/只、107.5EID50/只、107.2EID50/只、106.5EID50/只)；B1～B4组每组10只，分别胸肌注射MDCK悬浮源灭活疫苗，注射剂量为0.3、0.2、0.1、0.02 mL/只(107.7EID50/只、107.5EID50/只、107.2EID50/只、106.5EID50/只)；C组5只鸡，不免疫接种，用于攻毒对照；D组5只鸡为健康对照。

1.2.4 试验鸡HI抗体检测 各组鸡均在免疫接种后7 d、14 d、21 d翅静脉采血、分离血清，待检测AIV HI抗体。

1.2.5 攻毒试验 免疫后21 d采血后，A1～A4, B1～B4，C组鸡分别翅静脉注射100倍稀释的AIV BX13攻毒毒株, 每只0.5 mL(病毒含量107.4EID50), D组5只鸡不做任何处理，为健康对照。

1.2.6 分毒试验 试验鸡攻毒后第3天，分别采集每只鸡的咽拭子和泄殖腔拭子，置于装有0.8mL生理盐水(含青、链霉素双抗1万单位，pH 7.2)的eppendorf管中，涡旋振荡混匀后，3000 r/min离心5 min, 取同一只鸡的咽拭子和泄殖腔拭子上清液混合作为1个样品，尿囊腔接种5枚10日龄SPF鸡胚，0.2 mL/胚。接种后定期照蛋，弃去24 h内死亡鸡胚，收获72～120 h死亡鸡胚尿囊液，分别测定HA价，至120 h, 按照分组分别收获活胚尿囊液，测定HA价。若同一只鸡的样品接种的5枚鸡胚中有1枚鸡胚的HA价≥4log2,该样品判定为分毒阳性。若接种样品的5枚鸡胚均为阴性，取5枚鸡胚尿囊液的混合液再接种5枚10龄SPF鸡胚进行盲传，最终确定样品的分毒结果。

2 结果与分析

2.1 疫苗制备 参照《中国兽药典》有关鸡禽流感疫苗的检验方法，对2种疫苗的试验室制品进行了物理性状和无菌检验，结果见表1。

表1 AIV BX13株鸡胚源疫苗与MDCK细胞源疫苗物理性状和无菌检验Tab 1 Physical characters and sterility test of AIV BX13 strain of the two vaccines

2.2 血清HI抗体消长规律 不同源和剂量疫苗免疫后7 d、14 d、21 d各组鸡的血清HI抗体，结果见表2。免疫前随机抽取90只21日龄试验鸡中10只，测定其AIV HI抗体水平均为阴性。以不同免疫剂量的鸡胚源疫苗和MDCK细胞源疫苗免疫21日龄SPF鸡后7 d，AIV HI抗体水平为0log2；免后14 d和21 d, 两种疫苗免疫鸡的HI抗体滴度随着免疫时间的增加而提高，同时也随着免疫剂量的增加而提高，两种疫苗免疫接种后21 d的 HI抗体也较免疫后7 d、14 d显著提高。MDCK细胞源疫苗免疫组与鸡胚源疫苗组均在免疫后21 d产生了更高水平的HI抗体。攻毒前攻毒对照组和健康对照组试验鸡HI 抗体均为阴性。

表2 禽流感BX13株不同源疫苗和剂量免疫后抗体消长规律Tab 2 Growth and decline of AIV BX13 HI titer after different source vaccines and doses of immunization

HI抗体单位log2

2.3 攻毒试验结果 攻毒保护试验结果见表3。攻毒试验结果显示，鸡胚源疫苗和细胞源疫苗免疫接种后21 d，用与制苗株同源的H9亚型 AIV BX13株翅静脉攻毒，鸡胚源疫苗免疫鸡的接种剂量为0.1 mL/只鸡(107.2EID50/只)以上时，试验鸡的攻毒保护率达到100%；MDCK细胞源疫苗免疫鸡的免疫剂量为0.2 mL/只鸡(107.5EID50/只)以上时，试验鸡的攻毒保护率达到100%。攻毒对照鸡均100%分毒阳性，健康对照鸡分毒阴性。

表3 2种灭活疫苗不同免疫接种剂量的攻毒试验结果Tab 3 The challenge results of the 2 vaccines with different immune doses

攻毒试验结果：阳性数/攻毒数(健康对照除外))

2.4 抗体水平与分毒阳性率的关系 抗体水平与分毒率关系结果分别见表4和表5。鸡胚源疫苗免疫后，3只AIV HI抗体为0log2～3log2的试验鸡均分毒阳性，5只AIV HI 抗体4log2～5log2的试验鸡均毒阴性， 7只AIV HI抗体为6的试验鸡1只分毒阳性，25只AIV HI 抗体为7log2～11log2的试验鸡，分毒阳性率为0，试验鸡均保护；MDCK细胞源疫苗免疫组，3只AIV HI抗体水平为0log2～3log2的试验鸡分毒阳性，9只AIV HI 抗体为4log2、5log2、6log2的试验鸡5只病毒分离阳性，12只AIV HI抗体为7log2的鸡1只分毒阳性，16只AIV HI抗体水平为8log2～10log2的试验鸡均未分离到病毒，100%保护。

表4 鸡胚源疫苗免疫后抗体水平与攻毒保护率的关系Tab 4 The relationship of AIV HI titer to the protection rate after chicken embryo-derived vaccine immunization

表5 MDCK细胞源疫苗免疫后抗体水平与保护率的关系Tab 5 The relationship of AIV HI titer to the protection rate after cell-derived vaccine immunization

3 讨论与结论

本研究分别采用鸡胚培养的方式和纯悬浮培养MDCK细胞的方式制备了2种H9亚型AIV BX13株灭活疫苗，以不同剂量(0.02、0.1、0.2和0.3 mL/只)免疫接种21日龄SPF鸡后两种疫苗均能诱发鸡只产生AIV HI抗体，免疫鸡的AIV HI抗体水平均随着免疫剂量的增加而提高。2种疫苗免疫后7 d均未检测到AIV HI抗体，免疫后14 d最高免疫剂量组鸡胚源疫苗免疫鸡的AIV HI抗体滴度最高达到3.6log2，MDCK细胞源疫苗AIV HI抗体滴度最高达到4.6log2，细胞源疫苗组稍高。免疫后21 d，两种疫苗免疫鸡的AIV HI抗体水平明显高于免后14 d,结果说明免疫时间和AIV HI抗体水平呈正相关。当免疫剂量为0.1～0.3 mL/只时，鸡胚源疫苗的抗体水平为7.0log2～8.8log2，细胞源疫苗的抗体水平为7.2log2～8.3log2。张建伟等[13]使用微载体悬浮培养MDCK细胞制备禽流感病毒疫苗，证明MDCK细胞制备的禽流感病毒疫苗具有较好的免疫效果，使用不同剂量接种21日龄SPF鸡，免后21 d HI抗体水平最高为5.6log2，如果以免疫后抗体水平评价免疫效果，与本研究对比，免疫剂量相同时，纯悬浮细胞源疫苗免疫效果明显高于贴壁培养的MDCK细胞源疫苗。

攻毒试验结果显示，本研究中相同免疫剂量时，鸡胚源疫苗的保护效果高于纯悬浮MDCK细胞制备的H9亚型AIV疫苗，鸡胚源病毒液制备的疫苗以0.1 mL/只(107.2EID50/只)剂量免疫就可以达到100%保护；细胞源病毒液制备的疫苗抗原以0.1 mL/只(107.2EID50/只)剂量免疫保护率为80%，当免疫剂量达到0.2～0.3 mL/只(107.5EID50/只～107.7EID50/只)时，保护率达到100%，说明当免疫剂量为0.2 mL/只(107.5EID50/只)以上时，鸡胚源疫苗和MDCK细胞源疫苗的攻毒保护率无显著差异。免疫剂量相同时，鸡胚源疫苗免疫效果高于细胞源疫苗的原因尚不清楚，笔者认为有以下几种原因，病毒在MDCK细胞中传代是否会导致病毒变异，抗原液中的MDCK细胞组分是否影响鸡的免疫应答，是否存在试验鸡只的个体差异等都有待进一步试验证实和深入研究。

鲜有学者针对使用悬浮MDCK细胞制备禽流感疫苗免疫鸡后产生的抗体水平与分毒阳性率的关系做过比较，本试验分析了2种疫苗免疫试验鸡后21 d，HI抗体滴度与分毒阳性率之间的关系。当使用鸡胚源疫苗免疫时，15只AIV HI抗体水平为0log2～6log2的试验鸡有4只分毒阳性，其中1只AIV HI为6log2也分毒阳性，因此不排除抗体水平为4log2～6log2鸡只感染AIV后向环境排毒的风险，当AIV HI抗体水平为7log2～11log2时，所有免疫鸡均未分离到病毒，说明使用鸡胚源抗原制备H9亚型AIV BX13株疫苗免疫试验鸡，当HI抗体滴度达到7log2时，即可阻止鸡只排毒。当使用MDCK细胞源疫苗免疫时，24只AIV HI抗体水平为0log2～7log2的试验鸡中9只分毒阳性，其中4只AIV HI抗体水平为6log2～7log2的试验鸡病毒分离阳性，说明细胞源疫苗的免疫效力可能稍低于鸡胚源疫苗，是疫苗本身的原因还是试验鸡只的个体原因尚待进一步确认，当细胞源疫苗免疫鸡的AIV HI抗体水平达到8log2以上时，鸡只停止向外排毒，说明该抗体水平可以有效抑制病毒的排放。综上所述，抗体水平与排毒有明显相关性，鸡胚苗源疫苗的AIV HI抗体滴度达到7log2，细胞苗源疫苗的AIV HI达到8log2时均可抑制病毒排放，本研究由于统计数量较少，也由于鸡只个体间存在差异，结论尚需更多数据验证。

本研究显示，如果用攻毒保护率评价疫苗的免疫效果，细胞苗与鸡胚苗尚有差异，但差异不大，通过进一步筛选对AIV敏感的细胞株和改进培养工艺，或许可以获得高产细胞株和高毒价的抗原，通过提高毒价获得与鸡胚苗一致的保护率的疫苗是可能的。

本研究的目的是找到一种能够替代鸡胚制备AIV疫苗抗原的方法，有学者研究发现，AIV在MDCK悬浮细胞上的增殖能力与MDCK贴壁细胞相当，可获得较高的病毒滴度，但贴壁细胞增殖病毒工艺复杂，同一批次细胞瓶中的病毒滴度也存在差异[14]。因此，悬浮培养细胞增殖AIV成为了研究热点。本研究采用纯悬浮的MDCK细胞接种AIV制备抗原和疫苗，通过AIV HI抗体检测和攻毒试验证明纯悬浮培养方式制备的AIV疫苗具有较好的免疫效果，使用该疫苗免疫SPF鸡，0.1 mL/只以上的免疫剂量免疫SPF鸡后21 d，抗体水平达到7.2log2～8.3log2, 0.2 mL/只的免疫剂量即可保护100%的鸡不向外界排毒，证明悬浮培养MDCK细胞制备的禽流感疫苗免疫效力确实可靠。本研究的结果为后续继续筛选对AIV增殖效率更高的MDCK细胞株和利用纯悬浮培养MDCK细胞制备AIV疫苗抗原奠定了基础。