金伟平 林鸣国

翼状胬肉是最常见的眼结膜病变，其特点为睑裂部球结膜血管组织增生并向角膜浸入，其突出的病理特征为变性，具有比较高的复发率，当胬肉组织不断增长时，可产生刺激症状，影响患者面容，甚至引起视力下降[1]。不断侵袭和纤维血管组织增殖是翼状胬肉形成的基础，角膜缘屏障和细胞间基质屏障的破坏可能是翼状胬肉进展的主要原因[2]。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）为基质金属蛋白家族主要成员，可降解细胞外基质，参与翼状胬肉的发生和发展。而基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP1）可抑制MMP-9 的活性，防止细胞外组织屏障被破坏[3]。血管内皮生长因子（VEGF）是高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，可诱导血管形成，参与翼状胬肉的发生发展[4]。血管抑素具有极强的新生血管生成抑制作用[5]，对恶性肿瘤的增殖、侵袭迁移具有抑制作用。本文对血管抑素对翼状胬肉细胞增殖及MMP-9、TIMP-1、VEGF 水平的影响进行研究，为翼状胬肉的治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 标本来源 翼状胬肉组织标本来自2015 年3 月至2016 年3 月舟山医院眼科中心手术切除的150 例初发翼状胬肉患者，正常结膜组织来自同期150 例视网膜脱离患者手术中切除的正常结膜组织。

1.2 手术方法翼状胬肉患者行翼状胬肉切除术+自体角膜缘干细胞移植术，手术由同一位眼科手术医生完成。患者麻醉成功后，从胬肉颈部剪开球结膜，分离胬肉组织和球结膜，从胬肉头部剥离至角膜缘，钝性分离胬肉体部至根部，剪除胬肉组织。在上方角膜缘分离球结膜组织至角膜缘内侧1mm 左右处，剪下薄层球结膜植片，将球结膜植片移至巩膜暴露区，缝合并固定植片。

1.3 主要试剂 D-Hanks 液、FBS、DMEM 培养基、胰蛋白酶、accutase 酶、四唑盐（MTT）、二甲基亚砜购自美国Sigma 公司，Trizol 试剂盒、RT-PCR 试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒均购自美国CST 公司；MMP-9、TIMP-1、VEGF 引物均购自上海天根生化科技有限公司设计并合成，瑞斯托霉素诱导的血小板聚集（RIPA）裂解液，β-actin 抗体、辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG 抗体、兔抗人MMP-9 多克隆抗体、兔抗人TIMP-1 多克隆抗体、兔抗人VEGF 多克隆抗体购自美国Gibco 公司，电化学发光（ECL）试剂盒购自美国Sigma 公司。

1.4 翼状胬肉细胞和正常结膜细胞培养 翼状胬肉细胞培养及鉴定：将手术切除的初发翼状胬肉组织标本浸润到D-Hanks 液中，采用组织块培养法，用含小牛血清的DMEM 培养基培养，培养至原代贴壁细胞基本铺满瓶底时，用胰蛋白酶消化，以1∶2 的比例继续传代培养，取第3 代细胞，用链霉亲和素-生物素复合物法对抗波形蛋白免疫细胞进行化学染色，鉴定翼状胬肉细胞，鉴定后翼状胬肉细胞用于后续实验。正常结膜细胞培养及鉴定：采用组织块培养法培养正常结膜细胞，待细胞爬壁后，将组织块取出，将爬壁细胞离心，常规培养，按照1:2 比例传代，对细胞进行抗增殖细胞核抗原抗体和角蛋白荧光标记鉴定为人正常结膜细胞。

1.5 细胞分组情况 将每例翼状胬肉组织分离的翼状胬肉细胞均分为胬肉对照组150 例和血管抑素组150例，并设正常结膜细胞为正常对照组150 例，胬肉对照组和正常对照组用空白对照培养基培养，血管抑素组用含50ml/L 血管抑素的培养基培养。

1.6 血管抑素组和胬肉对照组翼状胬肉细胞增殖情况测定 采用MTT 比色法。取上述培养的第3 代翼状胬肉细胞，胰蛋白酶消化后制成翼状胬肉细胞单细胞悬液，置离心管中离心（1 000r/min）2min，去上清液，加入accutase 酶消化，离心（1 000r/min）2min，加入培养基吹打均匀后制成单细胞悬液。胬肉对照组和血管抑素组各自培养48h 后，调整两组翼状胬肉细胞浓度为1×104/ml，接种到96 孔板中，分别在0、24、48、72h 取出96 孔板加入20μl MTT 溶液（5mg/ml）孵育4h，酶标仪测定波长490nm 的吸光度值。

1.7 各组细胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF mRNA 表达水平测定 采用RT-PCR 法。取上述培养的第3 代翼状胬肉细胞，3 组细胞各自培养48h 后，加入Trizol 裂解液裂解细胞，提取细胞总RNA，根据RNA 反转录为cDNA，采用RT-PCR 法测定翼状胬肉细胞中MMP-9（上游引物：5′-GACTCGGTGTTTGATGAGCC-3′，下游引物为：5′-GAACTCAGACGCCAGTACAA-3′）、TIMP-1（上游引物：5′-CAGAA CCCCAGGGACGAG-3′，下游引物为：5′-CCCAGAGAACCAGGCAGC-3′）、VEGF（上游引物：5′-TGGACGCTGGCTTGACTGCTG-3′，下游引物为：5′-GGCAACAGCTGCGCTGTACA-3′）mRNA 水平，RTPCR 反 应 条 件 为：95℃10s、95℃30s、56℃15s、60℃60s，72℃30s，共40 个循环。以2-ΔΔCt表示翼状胬肉细胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF mRNA 表达水平。

1.8 各组翼状胬肉细胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 蛋白表达水平测定 采用Western blot 法。取上述培养的第3 代翼状胬肉细胞，各组细胞培养48h 后，加入RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度。将蛋白进行电泳、转膜、脱脂奶粉封闭，加入一抗过夜孵育，以β-actin 为内参照，加入二抗孵育2h，ECL 显影拍照，BioRad 图像分析系统分析条带灰度值，目标蛋白表达水平以目标蛋白条带灰度值/β-actin 条带灰度值表示。

1.9 统计学处理 采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以表示，血管抑素组和胬肉对照组翼状胬肉细胞不同时点吸光度值比较采用重复测量数据方差分析；3 组间MMP-9 等指标的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。胬肉对照组翼状胬肉细胞中MMP-9、TIMP-1 与VEGF 的相关性分析采用Pearson 相关。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血管抑素组和胬肉对照组翼状胬肉吸光度值比较血管抑素组和胬肉对照组不同时点翼状胬肉细胞吸光度值比较差异均有统计学意义（F=477.922、3496.405，均P＜0.01）。不同时点血管抑素组翼状胬肉细胞吸光度值均低于胬肉对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见表1。

表1 血管抑素组和胬肉对照组各时点翼状胬肉细胞吸光度值比较

2.2 3 组细胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF mRNA 表达水平比较 血管抑素组和胬肉对照组MMP-9、TIMP-1、VEGF mRNA 表达水平均高于正常对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而血管抑素组MMP-9、TIMP-1、VEGF mRNA 表达水平均低于胬肉对照组，且差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

2.3 3 组细胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 蛋白表达水平比较 血管抑素组和胬肉对照组MMP-9、TIMP-1、VEGF 蛋白表达水平均高于正常对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而血管抑素组细胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 蛋白表达水平均低于胬肉对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表3、图1。

表2 3 组细胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF mRNA 表达水平比较

表3 各组胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 蛋白表达水平比较

图1 各组翼状胬肉细胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 蛋白电泳图（A 为正常对照组，B 为胬肉对照组，C 为血管抑素组）

2.4 胬肉对照组翼状胬肉细胞中MMP-9、TIMP-1 与VEGF mRNA 表达的相关性 胬肉对照组翼状胬肉细胞中MMP-9 与VEGF mRNA 的表达呈正相关（r=0.621，P＜0.01），TIMP-1 与VEGF mRNA 无相关性（r=0.079，P＞0.05）。

2.5 胬肉对照组翼状胬肉细胞中MMP-9、TIMP-1 与VEGF 蛋白表达的相关性 胬肉对照组翼状胬肉细胞中MMP-9 与VEGF 蛋白的表达呈正相关（r=0.602，P＜0.01），TIMP-1 与VEGF 蛋白的表达无相关性（r=0.114，P＞0.05）。

3 讨论

翼状胬肉可侵犯眼角膜引起散光，或遮盖瞳孔区引起视力下降[6]，严重者造成视力损害，影响患者的身心健康，应引起大家广泛重视[7]。翼状胬肉的发病机制比较复杂，以往认为翼状胬肉是一种变性性、增生性疾病，近年来研究发现增生是翼状胬肉的主要特点[8]。研究发现血管抑素对细胞增殖具有明显的抑制作用，本研究发现血管抑素对翼状胬肉细胞的增殖具有明显的抑制作用，表明血管抑素可能通过抑制翼状胬肉细胞增殖从而抑制翼状胬肉的发生、发展。

MMPs 在翼状胬肉的发病中具有重要作用，MMPs家族成员可溶解细胞间的半桥粒连接，增强翼状胬肉细胞的移行性，引起翼状胬肉细胞向各个方向离心性移动至角膜、结膜、角巩膜缘的基底膜上，浸入角膜的翼状胬肉细胞不断表达MMPs，破坏角膜前弹力层，引起角膜损伤[9]。MMP-9 是MMPs 家族主要成员，具有降解和重塑细胞外基质的功能[10]，在正常对照组织中，MMP-9 可通过分解和重塑细胞外基质实现对细胞外基质的重建，还可调控其它蛋白酶、炎症介质和细胞因子的活性[11]；MMP-9 对VEGF 具有调控作用，从而调控新生血管的生成[12]。TIMP-1 为多功能的分子，可抑制MMPs 的活性，抑制血管生成、刺激皮质类固醇的生成[13]。VEGF 可增强血管内皮细胞有丝分裂，通过特异性受体作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞分化、趋化作用和内皮细胞的迁移和增殖，可增强血管的通透性，促进基质细胞和新生血管生长，在翼状胬肉组织中VEGF 水平升高，VEGF 参与翼状胬肉的发生、发展[14-15]。翼状胬肉发病中纤维血管增殖和侵袭是其发病的基础，介于MMP-9、TIMP-1、VEGF 在细胞外基质动态平衡和血管生成方面发挥重要作用，李盈龙等[16]研究发现MMP-9 可通过促进VEGF 的产生、破坏细胞外基质屏障从而在翼状胬肉的发生、发展中发挥重要作用。由此推测抑制MMP-9和VEGF 可抑制翼状胬肉的发生、发展。

血管抑素是最强有力的新生血管生成抑制剂，可抑制纤溶酶原活性，造成细胞侵犯活性下降[17]；可通过调节纤溶酶的形成，影响细胞的迁移和侵犯能力；通过抑制血管内皮细胞的增生抑制新生血管形成，血管抑素直接作用于增殖状态的血管内皮细胞，对其他细胞及正常状态的内皮细胞没有抑制作用；血管抑素还可破坏已经建立的新生血管网状结构，从而抑制新生血管形成[18]。介于血管抑素具有影响细胞侵袭和侵犯能力，以及强有力的抑制血管形成作用，而MMP-9、TIMP-1、VEGF 在翼状胬肉发生、发展中发挥重要作用，由此推测血管抑素可能通过抑制MMP-9、TIMP-1、VEGF 抑制翼状胬肉的发生、发展。本文对其进行研究发现与正常细胞比较，翼状胬肉细胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 表达水平升高，MMP-9 与VEGF 表达水平呈正相关；血管抑素可抑制翼状胬肉细胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 表达水平。分析血管抑素对翼状胬肉的发生、发展具有抑制作用，其机制可能为翼状胬肉发病过程中，MMP-9 表达水平升高，为了维持细胞外基质平衡，TIMP-1 表达水平也相应升高，当MMP-9 升高速度高于TIMP-1 升高速度时导致翼状胬肉的生长；翼状胬肉是VEGF 表达水平也升高，促进新生血管的形成，在翼状胬肉发生中发挥作用，MMP-9 水平与VEGF 水平呈正相关表明MMP-9 除了可破坏细胞外基质外，还可能通过促进VEGF 生成促进翼状胬肉的发生。血管抑素可能通过抑制翼状胬肉细胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 水平抑制翼状胬肉血管形成抑制翼状胬肉的发生、发展。

综上所述，血管抑素可能通过抑制翼状胬肉细胞增殖和翼状胬肉血管生成抑制翼状胬肉生长的作用，血管抑素有望为翼状胬肉的治疗提供新的思路。